Артериальные и венозные тромбозы широко распространены среди пациентов с болезнями хирургического, онкологического, акушерско-гинекологического профиля. Эти патологические осложнения — среди первых мест в структуре заболеваемости и смертности, приводят к ухудшению качества жизни, инвалидизации, что обусловливает медицинскую значимость данной проблемы.
До 65% артериальных и 80% венозных тромбозов, не связанных с травмой или хирургическим вмешательством, ассоциированы с различными дефектами тромбоцитарного и плазменного звена системы гемостаза [1]. Примерно половину этих дефектов составляют случаи так называемой наследственной тромбофилии, то есть врожденной генетической аномалии, приводящей к патологической гиперкоагуляции [1]. Первой установлeнной причиной наследственной тромбофилии явился дефицит антитромбина III, позже были обнаружены дефициты протеинов С и S и другие причины (они приведены в табл. 1 [2, 3]). Несмотря на различие в механизмах действия, все они вызывают нарушение равновесия между антитромбогенными и тромбогенными факторами и в итоге ведут образованию тромба.
Повышенную свертываемость крови можно зафиксировать при помощи ряда коагулологических тестов (ПДФ, РФМК, фибринопептид А и Б, фрагмент 1.2 протромбина, тест генерации тромбина), в то же время они не всегда могут ответить на вопрос о первопричине такой гиперкоагуляции. Однако именно понимание патогенетического механизма тромбоза, исключение или констатация факта его наследственной предрасположенности позволяют правильно выбрать вариант и длительность антикоагулянтной терапии.
Современные диагностические средства дают возможность определить наслед¬ственный характер предрасположенности к тромбозу. При этом в качестве диагностических тестов чаще используют те варианты, в основе которых лежит полимеразная цепная реакция (ПЦР) (рис. 1).
Суть метода ПЦР заключается в многократном копировании (амплификации) определенных участков ДНК. В пробирке благодаря специальному термоустойчивому ферменту ДНК-полимеразы происходит реакция. Ее высокую специфичность обеспечивают особые стартовые блоки, представляющие собой специально синтезированные in vitro олигонуклеотиды длиной около 20—30 оснований, называемые праймерами. Они комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах амплифицируемого фрагмента. Именно с них начинается синтез новых цепей ДНК. ПЦР — это циклическая реакция, каждый цикл состоит из нескольких температурных режимов, которые подбираются с тем расчетом, чтобы начало синтеза и рост новой цепи ДНК протекали оптимально. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь вступают в эту реакцию амплификации. Поэтому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК (ампликонов), которые затем выявляют методом электрофореза или гибридизации с меченым ДНК-зондом.
На сегодняшний день оптимизированная ПЦР — это надежный лабораторный тест, обладающий высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью.
В данной статье приводится описание метода диагностики трех наиболее распространенных врожденных тромбофилических состояний, основанного на ПЦР с последующим рестрикционным анализом [4—6]. Это мутации генов пятого фактора свертывания 5 (мутация FV Leiden), протромбина (G20210A) и фермента 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR C677T).
Все они представляют собой так называемые точечные мутации — однонуклеотидные замены в цепи ДНК, которые искажают первоначальный генетический код и приводят к изменениям в функционально важных доменах белка (мутация
FV Leiden, MTHFR C677T) либо к усиленной экспрессии гена, следовательно, к повышенной концентрации белкового продукта (G20210A) (рис. 2). Золотым стандартом для выявления мутаций является секвенирование (определение первичной последовательности ДНК), однако данный метод неудобен для рутинной практики как дорогостоящий и длительный. Альтернативой секвенированию для выявления однонуклеотидных замен часто служит рестрикционный анализ. Основывается он на сайт-специфической эндонуклеазной активности специальных ферментов-рестриктаз, выделяемых из микроорганизмов. Такие ферменты способны с высокой точностью узнавать строго определенные 4-8-нуклеотидные последовательности или сайты ДНК (в данном случае это место нахождения точечной мутации) и только в случае узнавания расщепляют ДНК. Таким образом, мутантная ДНК и ДНК дикого типа различаются по своей «способности» быть расщепленными рестриктазой. После процесса рестрикции проводится электрофорез и по длине образовавшихся фрагментов делается вывод о наличии/отсутствии мутации у того или иного индивидуума.
Данный метод отличается простотой выполнения, не требует специальной аппаратной и реагентной базы в условиях клиники, уже имеющей молекулярно-биологическое подразделение. Метод предполагает использование стандартных ПЦР-реагентов, пригодных для других ПЦР: ПЦР-буфер, дезоксинуклеотидилтрифосфаты, хлорид магния, праймеры, ДНК-полимеразу и рестриктазу. Таким образом, отсутствует жесткая привязанность к продукции определенных фирм, сохраняется возможность гибкого подхода к выбору реагентов и их заменяемости.
Приведенный метод используется в ГУ «РНПЦ детской онкологии и гематологии» для диагностики врожденных тромбофилий у онко-гематологических пациентов детского возраста. Однако обследование может быть рекомендовано и следующим контингентам [7—9]:
• пациентам с артериальными или венозными тромбозами, возникшими в молодом возрасте (до 40 лет); с рецидивирующими артериальными и венозными тромбозами; с необычной локализацией тромбозов (мезентериальные, церебральные);
• людям, имеющим отягощенный семейный анамнез;
• женщинам с осложненным течением беременности (пре-эклампсией, отслоением плаценты, мертворождением, ретардацией плода);
• здоровым лицам, являющимся родственниками больных — носителей мутаций;
• здоровым женщинам с отягощенным семейным анамнезом перед беременностью, назначением заместительной гормональной терапии, приемом оральных контрацептивов.
Анализ проводится в трех различных помещениях (зонах 1—3). Правила зонирования точно соблюдаются, оборудование и растворы, предназначенные для работы в определенной зоне, должны быть строго стационарными. Смена халатов, резиновых перчаток при перемещении через зоны является обязательным условием. Поверхности столов, на которых проводится постановка ПЦР, необходимо подвергать УФ-излучению до и после работы. Соблюдение данных мер позволяет предотвратить появление ложно-положительных результатов (так называемое явление контаминации).
Для выделения клеток и ДНК (зона 1) используются следующие материалы: лизирующий раствор для эритроцитов, фосфатно-солевой буфер, раствор для лизиса лейкоцитов, фенол-хлороформ¬ная смесь, изопропиловый спирт, 700 этиловый спирт, ТЕ-буфер (Трис-ЕДТА, pH = 7,4). Применяемое оборудование: настольный бокс с бактерицидной лампой или ламинарный шкаф; вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой; микроцентрифуга для пробирок типа «эппендорф» до 12—16000 g; набор автоматических пипеток переменного объема; одноразовые полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл; одноразовые наконечники для пипеток переменного объема; холодильник с морозильной камерой; отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки; емкость с дезинфицирующим раствором.
Материалы, необходимые для ПЦР и рестрикционного анализа (зона 2): ПЦР-буфер, ДНК-полимераза, хлорид магния, смесь дезоксинуклеотидилтрифосфатов, вода, специфические праймеры, рестрикционная эндонуклеаза, буфер для рестрикции. Применяемое оборудование: ПЦР-бокс; отдельный набор автоматических пипеток переменного объема; одноразовые наконечники с аэрозольным барьером для пипеток переменного объема; одноразовые полипропиленовые пробирки объемом 0,5 и 0,2 мл; холодильник с морозильной камерой; отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки; емкость с дезинфицирующим раствором.
Материалы, необходимые для электрофоретического анализа продуктов ПЦР (зона 3): агароза, ТБЕ-буфер (трис-борат-ЕДТА, рН 8,0), этидиум бромид, загрузочный буфер, маркер молекулярного веса. Применяемое оборудование: камера для горизонтального электрофореза; источник постоянного тока с напряжением 150—450 В; ультрафиолетовый трансиллюминатор для просмотра гелей; система регистрации, обработки и учета полученных изображений; микроволновая печь или плитка с магнитной мешалкой для плавки агарозы; колбы стеклянные для варки геля; отдельный набор автоматических пипеток переменного объема; одноразовые наконечники с аэрозольным барьером для пипеток переменного объема; отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки; емкость с дезинфицирующим раствором.
Описание метода
Исходный материал для анализа — клеточная взвесь, содержащая 5—10 млн лейкоцитов, полученная из 4—10 мл периферической крови пациента. Выделение ДНК осуществляется методом экстракции фенол-хлороформной смесью с последующей преципитацией в спирте и растворением в ТЕ-буфере либо любым другим доступным способом.
Необходимые для ПЦР-смеси компоненты и использующиеся пропорции приведены в табл. 2. При этом олигонуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров представлены в табл. 3.
После окончания ПЦР следует убедиться в наличии качественного ПЦР-продукта путем предварительного анализа в 1,5%-м агарозном геле. После чего к 10 мкл амплификата добавляется соответствующая рестрикционная эндонуклеаза (для FV Leiden, G20210A, MTHFR C677T соответственно Mnl I, Hind III, Hinf I) и смесь инкубируется определенное время. Подробно условия рестрикции изложены в табл. 4.
После рестрикции проводили электрофорез в 3%-м агарозном геле. Мутантный и дикий типы при этом отличаются длиной рестрицированных фрагментов (табл. 5, рис. 3).

Литература
1. R.L. Bick. Hereditary and Acquired Thrombophilic Disorders. Appl Thrombosis / Hemostasis / 2006; 12(2):125—135.
2. Ф.Д. Шиффман. Патофизиология крови. — М., 2000. С. 253—275.
3. M.M. Samama, O.E. Dahl, D.J. Quinlan et al. Quantification of risk factors for venous throboembolism: a preliminary study for the development of a risk assessment tool. Haematologica. 2003; 88:1410—1421.
4. C. Schmitz, K. Lindpaintner, P. Verhoef et al. Genetic Polymorphism of Methylenetetrahydrofolate Reductase and Myocardial Infarction. Circulation. 1996; 94:1812—1814.
5. Z. Nassiruddin, A. Masood, A. Suhaib. Frequency of factor V Leiden mutation. JCPSP.2005; 15:15—17.
6. R. Poort, F/R/ Rosendaal, P. Reitsma et al. A common genetic variation in the 3-untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and increase venous thrombosis. Blood. 1996; 88:3698—3703.
7. V. de Stefano, E. Rossi, K. Paciaroni et al. Screening for inherited thrombophilia: indications and therapeutic implications. Haematologica. 2002; 87:1095—1108.
8. M. J. Kupferminc Ariel Many, A. Bar-Am, J.B. Lessing et al. Mid-trimester severe intrauterine growth restriction is associated with a high prevalence of thrombophilia. An International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 2002; 109:1373—1376.
9. Grandone E, Margaglione M, Calaizzo D, Addedda M, Cappucci G, Vecchione G et al Factor V Leiden is associated with repeated and recurrent unexplained fetal losses. Thrombosis and Haemostasis. 1997; 77:822—824.

Summary
Venous thrombosis is a common disease annually affecting 1 in 1000 individuals. The risk of venous thrombosis increases when the hemostatic balance between pro- and anticoagulant forces is shifted in favor of coagulation. When it is caused by an inherited defect, the resulting hypercoagulable state is life-long risk factor for thrombosis. Resistance to activated protein C is the most common inherited defect of hemostatic system. It is caused by a single point mutation in the Factor V gene — Factor V Leiden. This mutation is associated with 5-10-fold increased risk of thrombosis. The second most common inherited risk factor for thrombosis is a point mutation in the Factor II gene — G20210A mutation. This mutation is associated with mild risk for thrombosis. Combinations of mentioned above genetic defects with each other and with another possible genetic defects, e.g. with hyperhomocysteinemia, strongly increase risk for thrombosis.