Методы атомно-силовой микроскопии находят все более широкое применение в биологии, медицине и фармакологии. Атомно-силовой микроскоп (АСМ) имеет ряд преимуществ перед оптическим или растровым электронным. Во-первых, он позволяет получать истинно трехмерный рельеф исследуемой поверхности. Во-вторых, при его использовании не требуется, чтобы образец проводил электричество. Кроме того, измерения можно осуществлять не только в вакууме, но и на воздухе, в атмосфере любого газа и даже в капле жидкости. Последнее обстоятельство открывает широкие возможности для изучения органических молекул и живых клеток.
Методы исследования биологических объектов при помощи АСМ можно разделить на две основные группы: визуализация с высоким разрешением и оценка локальных механических свойств (эластичности). В настоящее время они показали свою эффективность в прикладной вирусологии при исследовании взаимодействий «вирус — клетка», в микробиологии для идентификации бактерий, в цитологии для изучения различных клеток, а также ДНК, РНК, тканей и даже органов [1—4]. Помимо визуализации возможность анализа механических свойств позволяет более глубоко изучать клеточные процессы, выяснять такие важнейшие свойства, как эластичность, мобильность поверхностных слоев, адгезия, молекулярное связывание и электростатичность. Можно говорить о том, что в настоящее время формируется новое направление в цитологии, которое определяют термином «клеточная наномеханика», или «клеточная эластография» [5]. Так называются методы визуализации сдвиговых упругих характеристик биологических мягких тканей. Они дополняют традиционные способы визуализации неоднородностей тканей и считаются перспективными для медицинской диагностики различных патологий. Эластография уже сегодня имеет широкое практическое применение в виде ультразвуковых, оптических и ЯМР-методов, которые позволяют получать и анализировать информацию о механических свойствах органов и тканей. Эти данные используются в онкологии, неврологии, травматологии, трансплантологии, дер¬матологии, анестезиологии, спортивной медицине и т.д. [6—8]. Благодаря возможностям АСМ стала доступна и клеточная эластография. Оценка структурных особенностей клеточной поверхности и локального модуля упругости представляет интерес как с точки зрения изучения экспериментальных воздействий на клетку патогенных факторов или фармакологических препаратов, так и с точки зрения исследования динамики механических свойств клеток при клеточной миграции, в процессе дифференцировки и клеточного старения. Кроме того, АСМ при взаимодействии зонда с поверхностью дает возможность проводить измерения изменения сил адгезии. Следовательно, в случае использования модифицированного зонда возможно определение локализации рецепторов или других структур на поверхности мембраны. АСМ-технологии позволяют визуализировать как различные иммунокомплексы антиген/антитело, так и белковые комплексы.
Так, например, основная проблема протеомики заключается в низком концентрационном пределе обнаружения и идентификации белков в биологическом материале традиционными методами — на уровне не ниже 10-12 М. Необходимость повышения концентрационной чувствительности на несколько порядков связана с тем, что подавляющее количество типов функциональных белков, которые могут быть в том числе и маркерами заболеваний, присутствуют в плазме крови, согласно оценкам, в гораздо более низких концент¬рациях, вплоть до нескольких молекул. В настоящее время активно развивается новый подход, основанный на использовании молекулярных детекторов, то есть детекторов, не измеряющих концентрации белков, а подсчитывающих единичные молекулы, совмещенные с системой биоспецифического мечения [9]. К молекулярным детекторам относятся нанодетекторы на базе АСМ. Таким образом, атомно-силовая микроскопия незаменима и для разработки диагностических систем, позволяющих выявлять маркеры некоторых заболеваний, поскольку применение такого нанотехнологического подхода в медицинской протеомике дает возможность повысить чувствительность медицинской диагностики.
Работы по изучению биологических объектов с помощью методов АСМ активно ведутся в лаборатории нанопроцессов и технологий Института тепло- и массообмена им. А.В. Лыкова НАН Беларуси. Одним из объектов исследования являются красные клетки крови человека. Выбор эритроцитов обусловлен тем, что данные клетки являются сравнительно простыми, легко доступными, и в то же время эритроцитарным мембранам присущи общие принципы организации биологических мембран [10]. Поэтому их удобно использовать в качестве естественной модели для выяснения общих структурно-функциональных характеристик мембран, а также изменений их механических свойств при различных заболеваниях. Совместно с РНПЦ «Кардиология» проводится научно-исследовательская работа по изучению изменений реологических свойств крови, состояния микроциркуляции и транспорта кислорода на ранних стадиях формирования сосудистых осложнений сахарного диабета второго типа. Один из ее этапов — выявление структурных особенностей и вязкоупругих свойств эритроцитов при нарушении транспорта глюкозы через клеточную мембрану методом сканирующей зондовой микроскопии. В настоящее время разработаны методики подготовки эритроцитов к АСМ-исследованиям, а также методика оценки локальных механических свойств поверхности клеток с использованием статической силовой спектроскопии.
Удалось установить, что у больных сахарным диабетом второго типа имеет место более высокая в сравнении с эритроцитами здоровых доноров вариабельность их морфологических и вязкоупругих свойств. Работа над данной тематикой продолжается и представляется актуальной, по¬скольку ее результаты могут стать основой для создания диагностических методов, позволяющих выявлять ранние признаки развития осложнений этого тяжелого и распространенного на сегодняшний день заболевания. Практическая значимость здесь определяется также возможностью разработки методов предупреждения развития осложнений сахарного диабета, что позволит повысить эффективность профилактики сердечно-сосудистых заболеваний и в первую очередь — ишемической болезни сердца.
АСМ-методики оказались востребованы и при изучении морфологии тромбоцитов. АСМ позволяет получать детальные изображения отдельных фрагментов сканируемой поверхности, а следовательно — проследить за изменениями цитолеммы клетки на разных стадиях ее жизнедеятельности в реальном времени. Используя различные режимы, были исследованы процессы, связанные с активацией тромбоцитов: изменение формы клетки, перемещение внутриклеточных гранул, детали цитоскелета, а также установлен уровень сил, при котором тромбоциты активировались. Очевидно, что на основе АСМ можно разработать клиническую методику оценки морфофункциональной активности тромбоцитов, базирующуюся на морфометрии большого числа одновременно визуализируемых клеток.
Еще одним объектом нашего изучения являются культивируемые in vitro в Институте цитологии и генетики НАН Беларуси иммортальные клетки (эмбриональные фибробласты) и клетки рака легкого (линия А549).
Цель данной работы — выявление особенностей строения мембраны иммортальных и опухолевых клеток, а также количественная оценка упругих свойств их мембран. Исследование представляется перспективным, поскольку изменение структурных и механических свойств клетки является следствием или может приводить к возникновению и развитию некоторых заболеваний, в том числе и рака [11]. Уже первые проведенные эксперименты показали, что упругость мембраны клетки, находящейся на стадии инициации, когда она еще может вернуться на путь нормального развития, выше, чем у опухолевой. Возможно, именно изменение структуры цитоскелета и увеличение эластичности опухолевых клеток является одним из факторов, объясняющих их проникновение в соседние ткани и органы, то есть процесс образования метастаз. По мнению некоторых авторов, изучение структурно-механических свойств мембран позволит в будущем отличать больные клетки от здоровых. А это может привести к развитию новой методики профилактики и диагностики раковых заболеваний [11].
Таким образом, атомно-силовая микроскопия — не просто метод визуализации исследуемых объектов с высоким разрешением, но и очень перспективный путь изучения локальных механических и биофизических свойств отдельных клеток, а также, в случае работы в жидкости, способ оценки влияния на клетку различных патогенных факторов или фармакологических препаратов. Однако, если говорить об исследованиях в области биологии и медицины, в настоящее время зондовая микроскопия еще очень далека от состояния рутинной методики. Она сталкивается с рядом специфических ограничений и трудностей, связанных с самой природой биологических объектов. Их преодоление должно способствовать развитию новых методов выявления, диагностики и лечения ряда заболеваний.