В организации медико-экологических исследований важную роль играет точный выбор индикаторов/маркеров, способных дать оценку тех или иных взаимосвязей между биологической системой и потенциально опасными факторами окружающей среды, а также судить об особенностях взаимодействия загрязнителей природы как с отдельным человеком, так и с группой риска или популяцией, а в последующем — о вероятности развития патологических изменений в организме.
Сегодня существует достаточно схем систематизации медико-биологических маркеров [1—4], однако наиболее точной из них, на наш взгляд, является предложенная А.П. Щербо и А.В. Кисилевым [4]. Согласно последней изменение содержания нитрозодиметиламина (НДМА) в объектах окружающей среды и биологических жидкостях организма можно рассматривать с позиции маркера/индикатора, способного охарактеризовать как качество упомянутых объектов (содержание и степень загрязнения НДМА), так и уровень здоровья конкретного человека или группы в целом (оценка канцерогенного риска в результате загрязнения воздуха, продуктов питания, воды и т.д.). В группе таких маркеров выделяют неспецифические (оценка воздуха на содержание NOх, SOх, COх и т.д.) и специфические, определяющие источник загрязнения и патологические изменения, которые они способны вызвать. Обоснование роли НДМА как маркера/индикатора состояния окружающей среды объясняется наличием тех или иных предпосылок, свидетельствующих о канцерогенном действии нитрозодиметиламина и его возможном влиянии на онкологическую заболеваемость населения. Так, острая интоксикация при воздействии НДМА у человека и животных протекает однотипно с проявлением токсического гепатита и развитием в последующем цирроза печени [5]; имеется ряд сообщений о вероятной этиологической роли N-НА, НДМА в возникновении рака желудка [7], пищевода, гортани [13], кишечника [10], печени, мочевого пузыря [6].
Однако, несмотря на большое количество информации о содержании НДМА в биологических жидкостях организма и его роли в этиологии рака [11], в литературе отсутствуют данные об использовании НДМА в качестве биомаркера злокачественного процесса, связи концентрации нитрозодиметиламина в биологических жидкостях организма онкологических больных с распространенностью злокачественных новообразований. Целью данной работы стало определение концентрации НДМА в организме клинически здоровых и больных раком и изучение его изменения в зависимости от распространенности злокачественного процесса в организме.
Материалом для исследования послужили биологические жидкости (кровь, моча) клинически здоровых людей (23 человека) и онкологических пациентов (68 человек), обследованных в стационаре Республиканского научно-практического центра онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н. Александрова. Диагноз заболевания у больных установлен при клинико-инструментальном обследовании и подтвержден результатами гистологического исследования опухолей. Все измерения концентрации нитрозодиметиламина проводили на аналитическом спектрофотометрическом комплексе «ПКНА» согласно методике «Биологические объекты. Определение НДМА», аттестованной в соответствии с ГОСТ Р8.563 (свидетельство 09.14.166/2001). Полученные результаты обрабатывались в программе STATISTICA 6.0, с помощью которой построены гистограммы частот анализируемого признака в каждой из выборок, рассчитан средний интервал значений, ошибка среднего значения и доверительный интервал с заданной точностью 95%, определены закономерности изменения концентрации НДМА в биологических жидкостях клинически здоровых и больных раком мочевого пузыря (РМП) от распространенности злокачественного процесса и получен коэффициент корреляции (r). Характер статистического распределения признака у клинически здоровых и больных РМП соответствовал нормальному в выборке (тест Kolmogorov-Smirnov test и Shapiro-Wilks W test).
Проведенный анализ показал, что концентрация НДМА зависит от изменения физико-химических данных биологической пробы. Так, в биологических жидкостях больных раком мочевого пузыря концентрация нитрит-иона выше концентрации, отмеченной у клинически здоровых лиц, при этом анализировалось значение удельной активности биологического образца (по 137Cs). В результате доказано, что взаимосвязи между наличием патологии и повышенной удельной активностью биологической пробы не прослеживается, однако величина удельной активности влияет на концентрацию НДМА в изучаемом образце у обеих групп исследуемых.
Анализ различий между концентрациями НДМА в биологических жидкостях больных раком мочевого пузыря показал достоверно значимое (р < 0,001) превышение концентрации НДМА по сравнению с соответствующей им группой клинически здоровых лиц, что отражено на рис. 1.
Определение среднего диапазона колебаний концентрации НДМА в биологических жидкостях организма клинически здоровых и больных РМП осуществлялось на основании построения графика частот концентраций НДМА в выборке. При этом выбирали тот диапазон значений НДМА, который при соблюдении закона нормального распределения признака (куполообразная кривая на рис. 2—7) был отмечен у пациентов.
Результаты анализа концентрации нитрозодиметиламина в крови клинически здоровых лиц показали, что в среднем уровень НДМА у них изменяется в интервале от 14 до 18х10-4 мг/л (рис. 2), в то время как в крови больных он в 2 раза выше и составляет (25—35)х10-4 мг/л (рис. 3).
Исследования изменения концентрации НДМА в сыворотке крови клинически здоровых лиц свидетельствуют, что средний его уровень находится в пределах (30—40)х10-4 мг/л (рис. 4), а в группе пациентов с диагнозом РМП — в диапазоне (70—80)х10-4 мг/л (рис. 5).
Анализ концентрации НДМА в моче клинически здоровых лиц показал, что она колеблется в интервале (40—50)х10-4 мг/л (рис. 6), в то время как в моче больных РМП она в 2—3 раза выше и составляет (110—120)х10-4 мг/л (рис. 7).
Необходимо отметить, что при определении концентрации НДМА и установлении границы норма/патология, на наш взгляд, не следует пользоваться средним значением концентрации НДМА и статистической ошибкой среднего, так как они не могут показать, с какой частотой встречается наблюдаемый признак в выборке. По нашему мнению, более информативным является определение среднего диапазона концентрации НДМА в биологических жидкостях организма (табл. 1), поскольку он отражает частоту случаев определенных концентраций НДМА у здоровых лиц и онкологических больных. Определение среднего диапазона колебаний концентрации НДМА в биологических жидкостях организма клинически здоровых и больных РМП осуществлялось, исходя из диапазона значений концентрации НДМА у пациентов — это проекция на ось Х от вершины кривой на рис. 2—7, отражающей нормальное распределение признака в выборке.
Результаты исследования изменения концентрации НДМА в биологических жидкостях клинически больных РМП показывают, что его содержание в крови и сыворотке в 2 раза, а в моче в 2—3 раза выше уровня НДМА, зафиксированного у клинически здоровых лиц. Полученные значения в крови здоровых (1,4—1,8 мкг/л) количественно близки к данным Gough T.A. [9] и Tannenbaum S.R. [12], согласно которым концентрация НДМА в крови здорового человека зависит от питания и иных условий и варьирует от 0 до 1 мкг/л. Наблюдаемое ее увеличение в 2—3 раза в моче больных РМП по сравнению с контролем согласуется и с Tadao Kakizoe [11], где разница концентраций НДМА в моче здоровых и больных РМП также составила 2 раза.
На основании выполненных исследований содержания НДМА в организме клинически здоровых и больных раком мочевого пузыря с учетом ранее полученных данных (патент РФ №2157528) проведено изучение динамики концентрации нитрозодиметиламина в моче клинически здоровых и больных раком мочевого пузыря, результаты которого отражены на рис. 8 и 9.
Как показано на рис. 8, в организме у здорового человека наблюдаются постоянные индивидуальные колебания концентрации НДМА (кривая А). Уменьшение амплитуды колебаний (Б) и постоянно удерживающийся уровень концентрации НДМА выше среднего значения (В), по нашему мнению, характеризует переход к возможным предпатологическим изменениям в организме, напряженности и сбою иммунного ответа. При этом стабильное увеличение концентрации НДМА (Г) в моче, на наш взгляд, может повлечь истощение системы детоксикации N-НА, в результате чего могут возникнуть патологические изменения в организме, что потребует в дальнейшем детального диагностического обследования пациента. Наблюдения за изменениями концентрации НДМА в организме при наличии злокачественного процесса в мочевом пузыре показывают стабильно высокий уровень НДМА в моче (А), его снижение в послеоперационном периоде (Б) и норму при выздоровлении (В) (рис. 9).
Анализ закономерностей изменения концентрации НДМА в организме больных раком мочевого пузыря с учетом распространенности злокачественного процесса позволил предположить о существовании корреляции между этими показателями. Полученные нами результаты исследования свидетельствуют о достоверно значимой (р < 0,001) корреляции между стадией рака мочевого пузыря и концентрацией НДМА в моче больных, коэффициент корреляции составил 0,80. Достоверно значимая (р < 0,001), но слабее выраженная корреляция наблюдалась между стадией рака мочевого пузыря и концентрацией НДМА в крови, коэффициент корреляции — 0,46.
Известно, что идеальный опухолевый маркер должен соответствовать предъявляемым к нему основным критериям:
• появляться в высоких концентрациях в биологических жидкостях;
• его концентрация должна коррелировать со стадией заболевания;
• его концентрация должна коррелировать с прогнозом;
• его концентрация должна коррелировать с эффектом лечения;
• его концентрация должна коррелировать с размером опухоли;
• продуцироваться только злокачественными клетками;
• являться органоспецифичным;
• позволять проводить диагностику всей опухолевой ткани.
Следует отметить, что в настоящее время не обнаружено идеального маркера, отвечающего всем перечисленным выше требованиям, а используемые в диагностике соответствуют лишь некоторым из них.
Полученные нами экспериментальные данные по исследованию концентрации НДМА в биологических жидкостях организма клинически здоровых и больных РМП и установленные на основании их зависимости достоверного увеличения концентрации НДМА у онкологических больных и корреляция уровня НДМА со стадией заболевания соответствуют трем первым перечисленным критериям, предъявляемым к опухолевым маркерам.
Кроме этого, концентрация НДМА коррелирует с эффектом лечения, что подтверждают ранее проведенные (патент РФ) клинические наблюдения за динамикой концентрации НДМА в моче больных РМП до и после оперативного хирургического вмешательства (рис. 9). Отмеченные изменения концентрации НДМА в результате эффекта лечения — еще один, четвертый, критерий, свидетельствующий о соответствии НДМА термину «опухолевый маркер».
Таким образом, полученные результаты экспериментально обосновывают возможность применения определения НДМА в биологических жидкостях организма в качестве одного из маркеров опухолевого процесса в мочевом пузыре. Данные исследования использованы при модификации «Методики выполнения измерений концентрации нитрит-иона в биологических жидкостях организма спектрофотометрическим методом», аттестованной в соответствии с ГОСТ 8.010-99 в Белорусском государственном институте метрологии (свидетельство №460/2007). Диагностические критерии и информативность определения НДМА в биологических жидкостях организма в дальнейшем поможет дать оценку эффективности его применения для диагностики РМП по сравнению с опухолевыми маркерами UBC и CYFRA 21-1. Предлагаемый метод актуален по своей практической значимости: он позволит выявить группы риска онкологических больных раком мочевого пузыря, а использование наряду с маркерами CYFRA 21-1 и UBC в клиниках и онкодиспансерах республики повысит эффективность скрининга злокачественной патологии мочевого пузыря.