В соответствии с положениями Согласованной на глобальном уровне системы классификации и маркировки химических веществ оценка токсичности химических веществ и смесей для водной среды проводится методом биологического тестирования [1]. Область применения водных биотестов распространяется в том числе и на контроль токсичности сточных вод, природной воды, вытяжек из полимерных материалов и т.д. Эксперименты по оценке акватоксичности регламентируются множеством стандартных методик, однако допускаются и приветствуются методы с использованием интродуцированных на местном уровне объектов, если они расцениваются в качестве эквивалентных и выбраны в соответствии с Руководящими принципами проведения испытаний Организации экономического сотрудниче¬ства и развития либо эквивалентными правилами надлежащей лабораторной практики.
В качестве тест-объектов для биотестирования применяются более 500 видов водных организмов — от микроорганизмов и водорослей до рыб. Для акватоксикологической оценки химических веществ и смесей общепринятым является использование батареи тестов, включающей рыб, беспозвоночных, водорослей и бактерий. Возможность практического выбора того или иного биотеста при оценке токсичности определяется его основными характеристиками, важнейшие из которых — биологические особенности объекта и чувствительность к воздейст¬вию различных химических веществ [2]. Общепризнан факт, что идеального тест-объекта, обладающего выраженной чувствительностью ко всем без исключения химическим соединениям, не существует. Поэтому поиск и разработка биотестов, чувствительных к отдельным группам веществ, — актуальная задача.
Целью настоящих исследований является поиск и адаптация новых альтернативных тест-объектов из числа ракообразных, характерных для водных экосистем Республики Беларусь и обладающих преимуществами по сравнению со стандартизованными тест-моделями. На предыдущих этапах в качестве потенциального тест-объекта для оценки токсичности химических веществ и их смесей выбран вид Сypridopsis vidua (Ostracoda, Crustacean), разработаны условия его культивирования и методология проведения острого эксперимента с использованием выбранного тест-объекта. Выполнены эксперименты по сравнительной оценке чувствительности С. vidua и стандартизованной тест-модели Daphnia magnа (Cladocera, Crustacean) по отношению к дихромату калия, одноатомным спиртам, тяжелым металлам [3].
Целью данного этапа исследований являлась сравнительная характеристика чув¬ствительности ракообразных Сypridopsis vidua (Ostracoda) и Daphnia magnа (Cladocera) к хлорорганическим пестицидам на примере линдана. В эксперименте оценивали острую водную токсичность этого вещества.
Линдан — ?-изомер 1,2,3,4,5,6-гексахлорциклогексана. Хлорорганический пестицид с молекулярной массой 290,85, CAS №: 58899. Бесцветное кристаллическое вещество без запаха. Температура плавления 157,5—158,5 °С. Растворимость
(г на 100 г растворителя): в воде — 0,001; в ацетоне — 43,5; в метаноле — 7,4. Устойчив к воздействию света, окислителей, концентрированных кислот. Является инсектицидом кишечного и фумигантного действия. Легко всасывается в организм насекомого и вызывает быстрое поражение нервной системы. Применяют для обработки сельскохозяйственных культур (кроме овощных и плодовых), лесонасаждений, для борьбы с вредителями, обитающими в почвах, для протравливания семян, дезинсекции зернохранилищ, обработки древесины. Может поступать в водную среду с почвенными водами с обработанных сельскохозяйственных угодий.
Высокотоксичен для млекопитающих (медианная летальная доза (ЛД50) 25—200 мг/кг). Предельно допустимая концентрация (ПДК) для человека в воде — 0,002 мг/дм3 (1-й класс опасности) [4].
Тест-объектами были выбраны культуры ракообразных Daphnia magnа ЦГ-1 и Сypridopsis vidua ЦГ-2, содержащиеся при 12-часовом световом цикле и температуре 20 ± 2 °С. Кормление осуществлялось водорослями Сhlorella vulgaris (дополнительно для дафний 2 раза в неделю пекарские дрожжи). В качестве культивационной воды применялась отстоявшаяся не менее 3 суток водопроводная вода.
Для эксперимента использовали молодь D. magnа не старше 24 часов из синхронизированной партеногенетической культуры и С. vidua не старше 2 недель и размером не более 0,3 мм. Не реже одного раза в квартал проводили контроль чувствительности культур к референсному (эталонному) токсиканту — дихромату калия (K2Cr2O7) [5].
Для исследований использовали реактив аналитической степени чистоты, для растворения тестируемого вещества, а также в качестве контроля — дехлорированную путем отстаивания не менее 3 суток водопроводную воду. Приготовление концентраций для тестирования осуществлялось путем разведений из маточного раствора с высокой концентрацией, который готовился растворением точной навески линдана в разбавляющей воде. Измерение концентрации линдана в исходном растворе проводили методом газожидко¬стной хроматографии.
В установочном эксперименте, цель которого — определение диапазона концентраций для окончательного тестирования, ракообразных экспонировали следующими концентрациями линдана: 0,00001; 0,0001; 0,001; 0,01; 0,1 мг/дм3. На основании анализа полученных данных в окончательном эксперименте вещество испытывали в концентрациях:
• 0,001; 0,01; 0,03; 0,05; 0,07; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 и 0,5 мг/дм3 — на D. magna;
• 0,0001; 0,001; 0,003; 0,005; 0,007; 0,01; 0,03; 0,05; 0,07; 0,1 мг/дм3 — на C. vidua.
В статическом режиме каждой концентрации и контролю экспонировали 3 группы животных по 10 особей в каждой. В течение опыта их не кормили. Длительность экспозиции — 48 (D. magna) и 96 часов (C. vidua). Учет реакции проводился: для дафний — через 24 и 48 часов, для остракод — через 24, 48 и 96 часов после начала тестирования. Учитываемым эффектом была иммобилизация животных — отсутствие способности к движению в течение 15 секунд после легкого встряхивания тестируемого субстрата. Иммобилизацию дафний определяли визуально в проходящем свете, а остракод — в световом микроскопе при увеличении в 2—7 раз. Иммобилизованных животных удаляли из сосудов после регистрации наблюдений. Тест считался действительным, если иммобилизация в контроле не превышала 10%, что предусмотрено стандартной процедурой [5].
При манипуляции с ракообразными использовали стандартную лабораторную посуду: стеклянные стаканы, пипетки объемом 5 и 10 мл, одноканальные дозаторы фиксированного объема. Тестирование проводили в стеклянных химических стаканах объемом 250 мл. Всего было поставлено 4 эксперимента с C. vidua на 540 особях и 4 — с D. magna на 524 особях.
В табл. 1 приведены параметры токсичности линдана для D. magna в соответствии с данными базы ECOTOX на 01.03.2008 г. [6].
Основными оцениваемыми в эксперименте параметрами токсичности были медианная эффективная концентрация при 48-часовой экспозиции для D. magna (ЕС50-48) и 96-часовой для C. vidua (EС50-96),
для дополнительной характеристики тест-моделей рассчитывали ЕС16, ЕС84, а также ЕС10 и ЕС90 (начальная действующая концентрация и концентрация, вызывающая эффект у большинства подопытных животных, соответственно). Расчет ЕСn для каждого учетного периода осуществлялся методом пробит-анализа по Литчфилду — Уилкоксону в изложении М.Л. Беленького с использованием программы Microsoft Excell и устанавливался с доверительным интервалом 95%. Количественную зависимость «концентрация — эффект» и ее описание проводили с помощью пакета «Регрессия» программы Microsoft Excell, сравнение видовых зависимостей «концентрация — эффект» — с применением пакета «сравнение двух регрессионных линий» программы Stadia. Для сравнительной характеристики чувствительности тест-моделей к воздействию химического вещества использовался коэффициент сравнительной физиологической толерантности Trel = log(EC50A/EC50B), где А и В — сравниваемые виды [7], в нашем случае А — C. vidua, В — D. magna. Его отрицательные значения свидетельствуют о меньшей толерантности или большей чувствительности вида A к воздействию вещества. Так как значения Trel выражены в логарифмах, то одна единица представляет собой разницу в один порядок по величине. Для характеристики диапазонов чувствительности пользовались коэффициентами соотношения: EC50/EC10, EC90/EC10, EC90/EC50. Малые значения коэффициентов, в частности ЕС90/ЕС10 (отношение концентрации, вызывающей эффект у большинства подопытных животных, к начальной действующей концентрации), так же как и высокие значения коэффициента наклона регрессионной прямой, указывают на то, что при концентрациях, выше пороговых, данное вещество вызывает выраженный ответ у тест-модели на воздействие (малые изменения концентрации — выраженную реакцию).
Параметры токсичности линдана, установленные в ходе эксперимента при статическом режиме воздействия, представлены в табл. 2.
Графически зависимость «концентрация — эффект» для 48-часовой (D.magna) и 96-часовой (C.vidua) экспозиции, уравнения регрессии, коэффициенты детерминации R2 представлены на рис. 1—2.
Для обеих тест-моделей выявлена четкая логарифмическая зависимость «концентрация — эффект» (R2 > 0,89, для log-преобразованных данных r > 0,95). В табл. 3 представлены параметры зависимости «концентрация — эффект».
Сравнительный анализ регрессионных прямых, проведенный по log-преобразованным значениям концентраций, с использованием пакета «сравнение двух регрессионных линий» программы Stadia показал наличие статистически достоверных отличий в положении регрессионных прямых для 2 тест-организмов (P = 0,0001) при отсутствии отличий в коэффициенте наклона — они параллельны, что позволяет нам оперировать рассчитанными значениями ЕСn для сравнения двух тест-моделей.
Рис. 3 наглядно в логарифмической шкале графически отображает диапазоны чувствительности C. vidua и D. magna к линдану. Диапазон включает концентрации от ЕС10 (начальной действующей концентрации, вызывающей эффект у 10% животных — эффект статистически отличается от контроля) до ЕС90 (вызывающей эффект у большинства подопытных животных). Также на рисунок нанесены значения ЕС50.
В соответствии с полученными данными тест-модель C.vidua имеет большую чувствительность к воздействию линдана по сравнению с D.magna: значения ЕС50-96 0,006 мг/дм3 и ЕС50-48 0,083 мг/дм3 соответственно, Trel = -1,14. ЕС10 и ЕС90 для этих веществ также различаются на ~ 1 порядок (ниже для остракод). Это свидетельствует о сходстве реакций животных, но с различным порогом действия (ниже для остракод), что подтверждается практически близкими по размерности диапазонами чувствительности (рис. 3), а также статистически достоверным отсутствием разницы между коэффициентами наклона регрессионных прямых (Р = 0,0001) и коэффициентами соотношения параметров токсичности EC50/EC10, EC90/EC10, EC90/EC50 (рис. 4).
При сравнении зависимости токсичности исследуемого соединения для тест-организмов от периода экспозиции установлено, что с увеличением периода экспозиции медианная эффективная концентрация линдана для C. vidua снижается в 6,3 раза к 48 часам эксперимента, к концу эксперимента — в 10 раз, а для D. magna — в 4 раза, что графически представлено на рис. 5.
Медианные, начальные действующие концентрации и концентрации, вызывающие эффект у большинства подопытных животных в остром эксперименте с линданом для D. magna и C. vidua в зависимости от периода экспозиции, представлены в табл. 4.
Концентрации, вызывающие минимальный эффект у обеих тест-моделей, с увеличением экспозиции снижаются практически на порядок. EC90 у C. vidua для экспозиции в 48 часов — в 6,3 раза, в 96 часов — в 22,7 раза ниже по сравнению с 24-часовой экспозицией. Для D. magna эта разница не такая значительная — 1,6 раза.
Анализ видовой зависимости токсичности линдана от периода экспозиции подтвердил большую чувствительность предложенной нами тест-модели к линдану по сравнению с широко используемой дафнией.
Таким образом, результаты данного эксперимента характеризуют Cypridopsis vidua как более чувствительную тест-модель с ЕС50-96 на уровне 3 ПДК линдана в воде и ЕС10-96 0,25 ПДК. D. magna по отношению к данному соединению значительно менее чувствительна — ЕС50-48 на уровне 41 ПДК и ЕС10-48 — 3 ПДК. Данный факт позволяет нам рекомендовать C. vidua в качестве тест-объекта для оценки острой водной токсичности хлорорганических соединений, а также для тестирования токсичности природных вод в регионах, где существует вероятность их загрязнения водами с обрабатываемых пестицидами полей, а также сточными водами с площадок зернохранилищ и т.п. Причем, учитывая динамику ответа C. vidua на воздействие линдана, возможен сокращенный по времени (до 48 часов) вариант тестирования, существенно не снижающий достоверность исследований.