Для нормальной работы технологических схем с замкнутым оборотом воды необходимо обеспечить достаточную степень ее очистки, а также предотвратить развитие микроорганизмов. Присутствие последних, в первую очередь бактерий и мицелиальных грибов, затрудняет эксплуатацию системы [1].
На ЗАО «Атлант» в системе оборотного водоснабжения испытательной станции стиральных машин-автоматов (СМА) было зарегистрировано изменение качества воды, характеризующееся появлением мутности и неприятного запаха. При хранении СМА (до начала их эксплуатации) на поверхности резиновых уплотнителей дверок иногда наблюдались плесневые обрастания, которые исчезали после 1—3 стирок. Возникла задача определения способов борьбы с микробной контаминацией воды. Объектами исследования служили пробы воды, отобранные в разное время на испытательной станции из бака в системе оборотного водоснабжения, из манжет и патрубков слива в стиральных машинах с различными сроками хранения, а также экспериментально синтезированные в Институте химии новых материалов НАН Беларуси биоцидные препараты на основе полигексаметиленгуанидина (ПГМГ).
Для изучения микробиологического состава системы оборотного водоснабжения пробы воды серийно разводили в физиологическом растворе и высевали методом Коха на поверхность агаризованных питательных сред различного состава. Инкубировали посевы при 30 °С в течение 48—72 часов, после чего производили подсчет количества колоний преобладающих морфологических типов. Концентрацию жизнеспособных клеток в среде определяли как число колониеобразующих единиц в 1 мл воды (КОЕ/мл) с учетом разведений пробы.
Для получения чистых культур микроорганизмов отбирали по 2 колонии каждого преобладающего морфологического типа и рассевали их на соответствующей плотной среде до изолированных колоний методом истощающего штриха. После троекратной «расчистки» отобранных культур проводили микроскопическое исследование для подтверждения их однородности.
Идентифицировали бактерии и грибы с учетом морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков согласно общепринятым методикам [2], с использованием определителей бактерий [3] и мицелиальных грибов [4].
Для изучения чувствительности выделенных из оборотной воды микроорганизмов к биоцидным препаратам применяли суспензионный метод (для бактерий) и метод агаровых блоков (для грибов) [5]. Суть первого заключалась в следующем: к суспензии разведенных в жидкой питательной среде до 104 КОЕ/мл клеток бактерий добавляли растворы образцов антимикробных препаратов в определенных пропорциях, получая их действующие концентрации в диапазоне 0,050—0,005%. Инкубировали посевы сутки при 30 °С, после чего учитывали степень мутности суспензий и производили высевы на плотные питательные среды подходящего состава. После формирования изолированных колоний подсчитывали их количество и определяли концентрацию жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) с учетом фактора разведения суспензий.
Минимальную ингибирующую концентрацию биоцида (МИК) по отношению к той или иной бактериальной тест-культуре определяли как наименьшую (из испытанных) концентрацию антимикробного агента, при которой тормозится рост бактерий (суспензия после инкубирования остается прозрачной). Биоцидные свойства препаратов (способность обусловливать гибель клеток) оценивали с помощью параметра «выживаемость» (B) по формуле:
B = 100 (%),
где K1 — концентрация жизнеспособных клеток, обработанных биоцидом в суспензионном методе; K0 — исходная концентрация клеток в инокуляте.
Заключительной операцией технологического процесса изготовления СМА являются приемо-сдаточные испытания, которым подвергается каждая выпущенная машина. Они проводятся согласно методике, разработанной на ЗАО «Атлант». В ходе тестирования проверяется функционирование, водонепроницаемость уплотнений, целостность узлов и деталей СМА с заполнением бака водой. В этом процессе с поверхности деталей, контактирующих с водой, происходит смыв остатков консервационных и технологических смазок и других загрязнений. Периодически в системе оборотного водоснабжения осуществляется полная замена воды.
Исследование морфологических и физиолого-биохимических свойств микроорганизмов, выделенных из образцов воды, позволило отнести большинство из них к числу бактерий и мицелиальных грибов. В табл. 1 приведены результаты определения содержания клеток бактерий и колониеобразующих единиц (фрагментов мицелия и спор) грибов в исследованных пробах.
Как видно из табл. 1, концентрация жизнеспособных бактерий почти во всех образцах превышает критическую, приближаясь к 106 КОЕ/мл, причем преобладающими микроорганизмами, контаминирующими оборотную воду, являются бактерии. Обращает на себя внимание скорость роста числа микроорганизмов: в первый день после полной замены воды в системе оборотного водоснабжения (после очистки воды с помощью бензомаслоотделителя и фильтрационно-сорбционного модуля) в пробах из бака содержалось 2,9•102 КОЕ/мл бактерий, а уже через 4 дня — 3,8•105 КОЕ/мл. Такое быстрое увеличение можно объяснить следующими причинами:
• вода проходит через узлы и детали СМА, где происходит смыв различных веществ, их накопление, в том числе ПАВ, которые могут использоваться некоторыми бактериями в качестве источников углерода и энергии;
• интенсивность водных потоков обеспечивает обогащение воды кислородом воздуха, что способствует развитию аэробных бактерий;
• повышение температуры в летние месяцы благоприятствует росту большинства почвенных и водных бактерий.
Колонии преобладающих морфологических типов использовали для получения чистых культур, которые идентифицировали до рода. В табл. 2 приведена характеристика бактерий и грибов, доминирующих в составе оборотной воды и остатков воды из СМА после приемо-сдаточных испытаний.
Как следует из данных таблицы, большинство видов бактерий, доминирующих в составе оборотной воды и остатках воды из СМА, являются аэробами, и, таким образом, их развитие в оборотной воде должно стимулироваться постоянным обогащением жидкости кислородом воздуха, которое имеет место в интенсивных потоках, создаваемых в системе оборотного водоснабжения и при испытаниях стиральных машин.
Еще одна особенность выделенных из проб бактерий — их способность формировать слизистые слои на поверхности клеточной стенки. Об этом свидетель¬ствует внешний вид их колоний на поверхности питательного агара (рис. 1): многие колонии выглядят блестящими благодаря слизистым слоям в их составе. Клетки некоторых бактерий на микрофотографиях объединены в скопления за счет слизистых масс, что особенно хорошо заметно по отношению к Rhodococcus sp. РБЖ-1 (табл. 2).
В Институте химии новых материалов НАН Беларуси разработан ряд композиций биоцидных препаратов с широким спектром действия, включающих полигексаметиленгуанидин гидрохлорид (ПГМГ ГХ), полигексаметиленгуанидин фосфат (ПГМГ Ф) и четвертичное аммониевое соединение (ЧАС) в разных пропорциях. Эти соединения малотоксичны по отношению к теплокровным животным и человеку, не вызывают аллергию, не летучи, хорошо растворимы в воде, не имеют цвета и запаха, устойчивы при хранении, не приводят к коррозии оборудования и обладают высокой биоцидной и биостатической активностью по отношению к различного рода микроорганизмам: грибам, бактериям, водорослям, вирусам и др. [6]. Благодаря этим свойствам соединения данного ряда можно использовать для ограничения развития микроорганизмов в системе оборотного водоснабжения на испытательной станции СМА ЗАО «Атлант», что подтверждено проведенными микробиологическими исследованиями.
В табл. 3 приведены минимальные ингибирующие концентрации исследованных препаратов биоцидов по отношению к доминирующим в оборотной воде бактериальным штаммам.
Анализ представленных данных позволяет заключить, что среди шести бактериальных штаммов, которые отобраны в качестве доминирующих в составе контаминированной оборотной воды, наиболее устойчивыми к действию всех испытанных антибактериальных веществ являются Alcaligines sp. РБ-А и Paracoccus sp. РМ-1. Эти бактерии сохраняют способность развиваться в присутствии наиболее высоких концентраций антимикробных веществ; среди 6 испытанных препаратов биоцидов наиболее выраженной антибактериальной активностью обладают образцы ПГМГ ГХ : ЧАС (1:1) и ПГМГ Ф : ЧАС (1:1). Эти препараты оказывают ингибирующее действие на развитие бактерий при содержании в среде в самых низких концент¬рациях (не более 0,01%).
В табл. 4 приведены параметры, характеризующие антибактериальные свойства самых активных веществ по отношению к наиболее устойчивым бактериям. Как следует из представленных здесь данных, наиболее активные образцы антимикробных препаратов проявляют по отношению к самым устойчивым бактериям выраженные биоцидные свойства. При этом выживаемость бактерий обоих штаммов в присутствии препаратов ПГМГ ГХ : ЧАС (1:1) и ПГМГ Ф : ЧАС (1:1) не достигает даже 1%.
Таким образом, можно рекомендовать использование препаратов ПГМГ ГХ : ЧАС (1:1) и ПГМГ Ф : ЧАС (1:1) в концентрации 0,01% для борьбы с бактериями, контаминирующими оборотную воду на станции испытания стиральных машин ЗАО «Атлант».
Микромицеты, выделенные из образцов оборотной воды, исследованы в методе агаровых блоков по степени чувствительности к наиболее активным биоцидным препаратам. На рис. 2 приведены фрагменты чашек Петри с сусло-агаром, на которых вокруг агаровых блоков в течение 2 недель развивались микромицеты. Чем хуже были условия для этого, тем меньшая по ширине зона обрастания блока формировалась. Иными словами, ширина зоны разрастания мицелия обратно пропорциональна ингибирующей активности препаратов. В каждой чашке в составе питательной среды содержалось по 0,1% антимикробного вещества.
Можно видеть, что все испытанные препараты препятствовали развитию мицелиальных грибов (проявляли фунгистатическую активность), если сопоставлять результаты с контрольным посевом, где в составе среды отсутствовало биоцидное вещество. В то же время ни один из препаратов не вызывал гибель микромицетов, то есть не характеризовался фунгицидной активностью при испытании стандартным методом на питательной среде. Однако в оборотной воде условия для развития микромицетов иные: гораздо меньшее количество питательных веществ, более низкая концентрация мицелия и спор (табл. 1) и присутствуют факторы конкуренции, продуцируемые бактериями.
Для подтверждения возможности применения на станциях испытания стиральных машин ЗАО «Атлант» препаратов ПГМГ ГХ : ЧАС (1:1) и ПГМГ Ф : ЧАС (1:1) определяли их действие на микроорганизмы в составе оборотной воды. Отобранные из бака оборотной воды в начале испытаний пробы по 20 мл вносили в качалочные колбы, добавляли в каждую раствор одного из препаратов, получая действующие концентрации веществ 0,01%. Контрольной служила проба оборотной воды без биоцида (20 мл). Образцы инкубировали при 30 °С с аэрацией в течение 7 суток, после чего производили высевы на плотные питательные среды для учета числа сохранивших жизнеспособность клеток бактерий и грибов. В табл. 5 приведены полученные результаты.
Исследования микробиологического состава воды в системе оборотного водоснабжения на испытательной станции СМА ЗАО «Атлант» позволили выделить в виде чистых культур несколько штаммов бактерий и мицелиальных грибов, по отношению к которым испытана антимикробная активность серии новых разработанных в Беларуси биоцидных композиций. Показано, что две наиболее высокоэффективные из них в концентрации 0,01% снижают до минимума (< 101 КОЕ/мл) численность всех микроорганизмов в оборотной воде и могут обеспечить эффективный способ борьбы с микробной контаминацией.