В настоящее время титан и его сплавы широко применяются для создания имплантатов и других медицинских изделий [1, 2]. Важнейшими требованиями, предъявляемыми к имплантационным материалам, являются их биологическая совместимость (то есть отсутствие токсичности, мутагенности, карциногенности) и гистологическая совместимость [1—6].
Исследование токсичности имплантационных материалов в опытах in vitro с использованием культур клеток — надежный метод доклинической оценки их биосовместимости. С этой целью применяются культуры фибробластов, лимфоцитов, макрофагов и эпителиальных клеток, разработаны тесты in vitro с бактериальными тест-системами [7—10]. Влияние материала оценивают по таким показателям, как изменение морфологических свойств, ингибирование роста и развития клеточной популяции, угнетение метаболической активности и др. [5, 11, 12].
Использование микроорганизмов в качестве тест-объектов обладает рядом преимуществ:
• благодаря малым размерам клетки имеют большую площадь контакта с окружающей средой;
• высокая скорость роста и размножения позволяет за относительно короткое время проследить влияние вещества на несколько поколений клеток;
• можно проанализировать действие фактора на морфологические, физиологические, генетические свойства и т.д.;
• такие тесты дешевле, чем с использованием культур клеток.
Тест-организмом для оценки неспецифической токсичности может быть любой микроорганизм, не требующий особых условий культивирования. Бактерии рода Bifidobacterium — представители нормальной микрофлоры кишечника человека и теплокровных животных. Также они обнаруживаются в ротовой полости и мочеполовом тракте. Бифидобактериям принадлежит ведущая роль в нормализации микробиоценоза кишечника, под¬держании неспецифической резистентности организма, улучшении обмена веществ, стимуляции иммунной системы и т.д. Выбор их в качестве тест-культур был обусловлен рядом причин:
• изменения в количественном или качественном составе бифидофлоры могут способствовать развитию различных заболеваний, поэтому важно определить влияние имплантатов на клетки именно данных бактерий;
• бифидобактерии — анаэробные микроорганизмы, и это дает возможность проведения опытов in vitro в условиях, приближенных к in vivo, что неосуществимо при использовании аэробных организмов.
Цель данной работы — изучить биосовместимость титановых сплавов марок ВТ 1-0 и ВТ-6 в модельных опытах in vitro в условиях, приближенных к in vivo, с применением в качестве тест-объектов бактерий рода Bifidobacterium.
Материалом для исследований служили образцы титановых сплавов марки ВТ-6, отожженные при 1000 °С с последующей закалкой в воде (сплав №1) или на воздухе (сплав №2), и ВТ 1-0, отожженные при 920°С с закалкой в воде (сплав №3) или на воздухе (сплав №4). В работе использовали штаммы бифидобактерий Bifidobacterium adolescentis МС-42, B. adolescentis ГО-13, B. bifidum №1,
B. longum В379М, предоставленные сотрудниками Всероссийского научно-исследовательского и конструкторского молочного института и Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, и Bifidobacterium adolescentis 94 БИМ, депонированный как B. adolescentis БИМ В-87 в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов. Бактерии выращивали при 37°С в триптон-лактозной (ТЛ) среде (трип-
тон — 1%, лактоза — 1%, дрожжевой экстракт — 0,5%, натрия казеинат —
0,1%, аскорбиновая кислота — 0,05%, NaH2PO4x12H2O — 0,2%, K2HPO4 — 0,2%, MgSO4 — 0,1%, NaCl — 0,1%, цитрат аммония двухводный — 0,3%, агар-агар —
0,1%, рН 6,8). Для проведения экспериментов использовали 18-часовые физиологически активные (3-я генерация) культуры бифидобактерий.
Пластинки сплавов размером 10х1х5 мм полировали шлифовальной бумагой, стерилизовали автоклавированием (30 мин при 121 °С) и помещали в колбы на 50 мл. Колбы заполняли стерильной средой ТЛ, инокулировали (5% об.) 18-часовыми (~107 КОЕ/мл) культурами бифидобактерий и инкубировали в термостате при
37 °С. Параллельно культуры вносили в колбы со средой ТЛ, не содержащие сплава (контроль), которые выдерживали в тех же условиях, что и опытные варианты. Оценку влияния материалов на развитие популяций бифидобактерий осуществляли спустя 24 часа культивирования. Для изучения влияния долгосрочного присутствия титановых сплавов в среде на жизнеспособность бифидобактерий колбы с контрольными и опытными вариантами, после коррекции рН среды в диапазоне 6,8—7 насыщенным раствором гидрокарбоната натрия, помещали на хранение в холодильную камеру (+4 °С). Оценку жизнеспособности проводили через 3 месяца хранения.
Изучали формирование биопленок на поверхности титановых сплавов следующим образом: в центре чашек Петри с агаризованной (1,5% агара) средой ТЛ вырезали лунки диаметром 15 мм, в которые стерильно опускали пластинку одного из сплавов. Чашки инокулировали 10 мл бактериальной суспензии (~106 КОЕ/мл), помещали в станцию для выращивания микроаэрофильных микроорганизмов BUG BOX M (Ruskinn Technology, Англия) и инкубировали при 37 °С в смеси газов (10% СО2, 10% Н2, 80% N2) в течение 21 дня. Формирование биопленок определяли визуально. Учитывали наличие и обильность роста микроорганизмов на границе
агар — сплав и поверхности материала. Через 21 день инкубации пластинки сплавов стерильно извлекали из лунок и помещали в 10 мл жидкой среды ТЛ. Жизнеспособность бактерий, формирующих биопленки, оценивали по наличию роста через 24—72 часа культивирования при 37 °С.
Количество жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) определяли методом предельных разведений с последующим высевом в полужидкую (0,2% агара) тиогликолевую (ТГ) среду (ОАО «Биомед», Россия). Подсчет сформировавшихся колоний проводили через 48—72 часа культивирования при 37 °С. Физиологическую активность бифидобактерий оценивали по уровню накопления биомассы (определяли нефелометрически, путем измерения оптической плотности бактериальной суспензии относительно стерильной среды ТГ при ?=590 нм) и активности кислотообразования (регистрировали потенциометрически) через 24 часа культивирования. Изучение морфологических свойств бифидобактерий проводили с помощью световой микроскопии препаратов, окрашенных по методу Грама, и фазово-контрастной микроскопии нативных препаратов, используя микроскоп Nicon Eclipse E200 (Nicon corporation, Япония). Статистическую обработку данных осуществляли, применяя пакет программ «Microsoft Excel XP».
Результаты оценки влияния титановых сплавов на развитие популяций бифидобактерий представлены на рис. 1—2 и в табл. 1. Видно, что исследуемые материалы не оказывали отрицательного эффекта на скорость роста и активность кислотообразования данных микроорганизмов. Во всех случаях показатели накопления биомассы и активной кислотности среды в контрольных и опытных вариантах достоверно не отличались. Титр клеток бифидобактерий, выращенных в присутствии образцов титановых сплавов, соответствовал контрольным вариантам.
В то же время отмечена индивидуальная чувствительность культур к изучаемым сплавам. В отдельных случаях наблюдалось наличие незначительного стимулирующего или ингибирующего эффекта. Так, в присутствии в среде культивирования сплавов ВТ-6 и ВТ 1-0, закаленных на воздухе, отмечалось снижение титра клеток и накопления биомассы B. bifidum №1. Для остальных штаммов бифидобактерий присутствие исследуемых материалов приводило к повышению уровня накопления биомассы. При этом более выраженный стимулирующий эффект на развитие популяций B. adolescentis ГО-13 и B. adolescentis МС-42 оказывали сплавы марки ВТ-6, а в случае B. adolescentis 94 БИМ и B. longum В379М — марки ВТ 1-0 независимо от способа обработки.
Визуальных отличий в морфологии колоний, сформировавшихся после высева из контрольных и опытных вариантов, обнаружено не было: они имели типичную форму гвоздиков или гречишных зерен диаметром 1—3 мм (рис. 3). Микроскопическое исследование показало, что титановые сплавы не вызывали видимых на светооптическом уровне изменений морфологических свойств бифидобактерий, которые представляли собой грамположительные, прямые или слегка изогнутые ветвящиеся палочки с булавовидными утолщениями на концах (рис. 4). Образования разбухших инволюционных форм, характерных для культур, выращенных в неблагоприятных условиях или в присутствии токсических соединений, не наблюдалось. Полученные данные свидетельствуют о хорошей биосовместимости и отсутствии токсического действия титановых сплавов на развивающиеся популяции бифидобактерий.
Результаты изучения долговременного влияния титановых сплавов на жизнеспособность бифидобактерий представлены в табл. 2. Установлено, что титры клеток B. adolescentis 94 БИМ, B. adolescentis МС-42, B. adolescentis ГО-13 через 3 месяца хранения в присутствии сплава №1 и B. longum В379М в присутствии сплава №4, не отличались от показателей в контрольных вариантах. В то же время наблюдалась полная потеря жизнеспособности B. adolescentis ГО-13 и B. bifidum №1 в присутствии сплава №2, а также
B. longum В379М в присутствии сплава №1. В целом лучшее сохранение жизнеспособности бифидобактерий, независимо от штаммовой принадлежности, было отмечено в среде со сплавом №3. В то же время наблюдалась индивидуальная чувствительность тест-культур к титановым сплавам. Во всех вариантах опыта происходило существенное снижение титра клеток B. bifidum №1, в то время как выживаемость B. adolescentis 94 БИМ и
B. adolescentis МС-42 составляла 80—100%. Исходя из полученных данных, штаммы B. adolescentis 94 БИМ и B. adolescentis МС-42 были отобраны как перспективные тест-культуры для оценки биосовмес-
тимости сплавов в опытах in vitro.
Изучение формирования биопленок на поверхности титановых материалов показало, что все использованные в работе штаммы бифидобактерий уже через 24—48 ч культивирования в модельных условиях образовывали биопленку, которая увеличивалась по площади и плотности в течение всего времени инкубации. При этом культуры одинаково хорошо росли на плотной питательной среде, границе агар — сплав и поверхности исследуемых материалов, погруженных в жидкую среду ТЛ (табл. 3, рис. 5). Ингибирования пролиферации и изменения морфологических свойств бифидобактерий не наблюдалось. Через 21 день инкубации в модельных условиях поверхность титановых сплавов была покрыта многослойной биопленкой, состоящей из жизнеспособных микроорганизмов. Изучение морфологических свойств бифидобактерий, изолированных из биопленки, показало, что клетки отличаются небольшими размерами и преобладанием коккоидных форм. Данное явление, вероятно, объясняется реакцией микроорганизмов на увеличивающееся популяционное давление и истощение в среде питательных субстратов за счет длительного времени инкубации. Образования инволюционных и/или форм с аномальной морфологией не отмечалось. Приведенные результаты подтверждают полученные данные о хорошей биосовместимости титановых сплавов с клетками бактерий рода Bifidobacterium.
Лучшим материалом для создания имплантатов и других медицинских изделий в настоящее время принято считать титан и его сплавы, обладающие полным комплексом свойств, удовлетворяющих требованиям медицины: высокой коррозионной стойкостью, достаточной механической и циклической прочностью, износостойкостью, относительно низкой стоимостью. Высокая коррозионная стойкость объясняется быстрым образованием на поверхности пассивной оксидной пленки, препятствующей выходу ионов из имплантата в среду организма. Стойкость титана и его сплавов в пассивном состоянии значительно выше, чем у железа, хрома, никеля и нержавеющих сталей. Кроме того, эти материалы способны сохранять стойкое пассивное состояние в водных растворах, содержащих наряду с кислородом ионы хлора практически в любой концентрации. Стерилизация изделий из титановых сплавов кипячением, автоклавированием, парами формалина, обжиганием, погружением в спирт не вызывает повреждений металлической поверхности. Титановые сплавы обладают высокой механической и циклической прочностью, износостойкостью. Длительные испытания титана и его сплавов в качестве имплантируемых материалов показали, что они долговечны. Наиболее успешным оказалось их применение в стоматологии —
протезы из сплавов титана служат в течение 10—15 лет [1, 2].
Одним из важнейших критериев отбора имплантационных материалов является биосовместимость — отсутствие негативного влияния на организм. Использование микроорганизмов для оценки биосовместимости имплантатов в настоящее время сводится главным образом к определению их мутагенности и генотоксичности, хотя и прослеживается тенденция к более широкому применению бактериальных тест-систем [7—10]. Имеется ряд работ, посвященных изучению влияния титановых сплавов на микрофлору полости рта в стоматологическом протезировании [14, 15]. Однако, по нашему мнению, в настоящее время недостаточное внимание уделяется исследованию действия имплантационных материалов на представителей естественной микрофлоры. Известно, что после введения в организм имплантат и/или его компоненты вступают в контакт как с клетками окружающих тканей, так и со всей внутренней средой организма [5]. Таким образом, они будут воздействовать на микрофлору либо непосредственно (например, в случае челюстно-лицевых и стоматологических имплантатов), либо опосредованно через продукты окисления, диффундирующие в кровь, что может вызвать значительные изменения аутохтонной флоры. Установлено, что нарушения в составе нормофлоры могут приводить к развитию широкого спектра заболеваний, таких как гастрит, язвенная болезнь, диарея, колит, гипо- и гипертензия, ишемия, гипо- и гиперхолестеринемия, артрит, кариес, моче- и желчекаменная болезни, дерматит, аллергические реакции и т.д. Показано наличие корреляционной взаимосвязи между степью нарушения кишечного микробиоценоза и частотой развития гнойно-воспалительных процессов у больных в послеоперационный период [13]. Поэтому при изучении биосовместимости имплантационных материалов важно исследовать не только их токсичность по отношению к эукариотическим клеткам, но и влияние на представителей нормофлоры. Установлено, что многие соединения обладают одинаковой токсичностью по отношению к микроорганизмам и культурам клеток человека: у материалов с высокой антибактериальной активностью обычно обнаруживаются выраженные цитотоксические и мутагенные свойства [6, 9]. Исходя из этого, нами была разработана схема изучения биосовместимости титановых сплавов с использованием бактерий рода Bifidobacterium в модельных опытах in vitro и проведена оценка неспецифической токсичности сплавов марок ВТ 1-0 и ВТ-6. Показано отсутствие ингибирующего и/ или токсического действия титановых сплавов на развивающиеся популяции бифидобактерий. Установлено, что жизнеспособность бифидобактерий через 3 месяца хранения в присутствии сплавов ВТ 1-0 и ВТ-6 была несколько ниже по сравнению с контрольными вариантами, однако морфологические свойства культур существенно не изменялись. Изучение способности бактерий рода Bifidobacterium формировать биопленки на поверхности титановых сплавов показало, что через 24—48 часов культивирования бифидобактерии образуют многослойные биопленки, состоящие из жизнеспособных особей с характерной морфологией.
Таким образом, доказаны отсутствие неспецифической токсичности и хорошая биосовместимость титановых сплавов марок ВТ 1-0 и ВТ-6 с клетками микроорганизмов рода Bifidobacterium. Полученные данные могут быть востребованы для изучения биосовместимости имплантационных материалов, а также при разработке in vitro тестов для оценки неспецифической токсичности новых сплавов медицинского назначения.
Исследования проводились в рамках задания «Создание новых материалов на основе титановых и кобальтовых сплавов с биологически активными покрытиями для применения при изготовлении медицинских имплантатов» Государственной комплексной программы научных исследований «Физика кристаллических, неупорядоченных и атомно-молекулярных структур».