Современная медицина придает большое значение фармакологическим средствам, которые, в отличие от синтетических препаратов, мало токсичны, действуют мягче и могут длительно использоваться без заметных побочных явлений. К ним относятся фитопрепараты, к примеру экстрак¬ты растений, содержащие полифенолы, в частности флавоноиды, обладающие антиоксидантными и противовоспалительными свойствами. Объектом нашего исследования явился мультикомпонентный фитопрепарат «Компротэкс», содержащий биологически активные вещества. Среди них полифенольные соединения — таннины, флавоноиды, а также компоненты эфирных масел — ментол, цинеол, азулен, оказывающие антиоксидантное, противовоспалительное, спазмолитическое действие.
Целью исследования явилось определение и характеристика противовоспалительной активности данного отечественного фитокомплекса при его действии на отек кишки, макроскопические повреждения слизистой оболочки, а также на функциональные расстройства (нарушения моторики) ободочной кишки в условиях формирования стандартной модели колита, вызванного уксусной кислотой.
Для изучения патогенеза воспалительных заболеваний кишки часто применяется простая и высоковоспроизводимая модель колита, осуществляемая инстилляцией уксусной кислоты в толстую кишку крыс и по морфогистологическим и биохимическим показателям идентичная колиту у человека [6, 8]. С этой моделью, например, связан выброс тех же медиаторов воспаления, которые обнаружены в острой фазе данного заболевания у людей. При этом возникают эпителиальный и подслизистый некроз, интенсивный воспалительный отек слизистых и мышечных оболочек кишки, что является относительно специфичной реакцией на уксусную кислоту. С помощью указанной модели можно наблюдать увеличение уровня тканевой миелопероксидазы и влажного веса толстой кишки — общепринятых, существенно коррелирующих между собой показателей, свидетельствующих о развитии острого воспалительного процесса [9, 10].
Острые и полухронические опыты проводили на 110 самцах беспородных белых крыс массой 250—400 г. Перед манипуляциями животные голодали на протяжении 24 часов, имея свободный доступ к воде. Чтобы вызвать экспериментальный колит, каждую особь слегка наркотизировали эфиром, затем через анальное отверстие в толстую кишку на глубину 8 см вводили зонд, по которому инфузировали 1 мл уксусной кислоты (4% на 0,9% растворе NaCl). Чтобы избежать потери химического вещества, тем же путем вводили 0,5 мл воздуха, после чего крыса в течение минуты находилась в положении вниз головой. Затем животных размещали в клетках вивария на трое суток, то есть на срок, необходимый для максимального развития воспалительной реакции [6,8], доступ к воде не ограничивали. По прошествии этого времени воду в поилках заменяли жидкостью для питья, полученной путем разведения в 200 мл водопроводной воды 5 мл препарата «Компротэкс», изготовленного на 40 -градусном спирте, используемом в качестве экстрагента. Спирт, как известно, усиливает целебные качества трав [2]. Поэтому были проведены контрольные испытания, в которых питьевая жидкость представляла собой раствор 5 мл 40-градусного спирта в 200 мл воды (~ 1%-й раствор).
В острых опытах через 6 суток после инстилляции кислоты животных контрольной и опытной групп анестезировали, вводя внутрибрюшинно уретан в дозе 110 мг/100 г массы, лапаротомировали, отмечали в баллах отсутствие (0), наличие (1) или высокую степень (2) диареи. Сегменты толстой кишки длиною 2 см были удалены из области воспалительного инфильтрата или гиперемированной кишки и взвешены. Исследования проводили по визуальной аналоговой шкале слепым методом, фиксируя отсутствие (0), наличие (1) или высокую степень повреждений (2). Так, в один балл оценивали степень повреждения, проявляющуюся диареей, очаговой геморрагией, слабой гиперемией, слабым отеком, отдельными мелкими эрозиями. Двумя баллами отмечали диарею с кровью, тотальную геморрагию, выраженную гиперемию, умеренный и сильный отек, крупные линейные эрозии, некроз. Кроме того, отек, как патофизиологически кардинальный признак воспаления, дополнительно измеряли прямым весовым методом. Вычислялся так называемый кишечный коэффициент как отношение влажного веса сегмента дистального участка кишки конкретной длины (2 см) к весу крысы [10]. Разница между значениями кишечного коэффициента в опыте и в норме (здоровые крысы) характеризует величину экссудации. Использованный нами метод нахождения кишечного коэффициента не уступает микроскопическому, заключающемуся в измерении толщины (поперечника) кишечной стенки или биохимическому способу, состоящему из определения отношения влажного веса толстой кишки к уровню тканевого протеина [11]. Контролем в данном случае были сегменты толстой кишки интактных крыс, соответствующие наиболее повреждаемым участкам кишки животных с экспериментальным колитом. Эти сегменты также подвергали весовому контролю.
В отдельных сериях острых опытов после лапаротомии здоровым либо подвергнутым экспериментальному колиту животным на поверхность нисходящей ободочной кишки (во втором случае пораженной воспалительным процессом) для отведения потенциалов гладких мышц (ПГМ) накладывали внеклеточные биполярные позолоченные электроды, подключенные к усилителю биопотенциалов УБФ-4-01 (постоянная времени — 2,2 с) компьютеризированной электрофизиологической установки. Сигналы от усилителя биопотенциалов записывали на жесткий диск, затем анализировали по программам, созданным в Институте физиологии НАН Беларуси [3]. При обработке результатов на компьютере количественную оценку данных проводили путем измерения амплитуды импульсов, а статистическую обработку осуществляли с учетом t-критерия Стьюдента. Контролем служили животные с экспериментальной патологией без лечения. Опыты начинали через полчаса после окончания подготовки объекта к записи потенциалов. Регистрировали активность участков нисходящей толстой кишки в течение часа.
Влияние «Компротэкса» на макроморфологические повреждения толстой кишки
Нами установлено, что после инстилляции уксусной кислоты у животных с максимально развитой в течение 2—4 суток воспалительной патологией имели место симптоматические расстройства в виде тяжелой диареи и патоморфологические изменения в форме геморрагии в полость толстой кишки, а также выраженные деструктивные изменения слизистой и частично мышечной оболочки — воспалительный инфильтрат, явления некроза, отслоения эпителия (эксфолиации) в форме глубоких продольных эрозий, разной степени отека кишки. Кровеносные сосуды были расширены, гиперемичны. Визуально на просвет кишка имела темно-красный оттенок вплоть до черного, некротического — явный признак интенсивного воспаления и нарушения функционального состояния органа. У здоровых животных повреждения отсутствовали, тогда как в условиях колита оценивались в среднем 6,6 ± 0,51 балла (n = 25), кишечный коэффициент составил в среднем 0,73 ± 0,056 г (n = 10), тогда как в разгар экспериментального колита повысился до 1,51 ± 0,048 г, n = 25, Р < 0,05.
На 7—10-е сутки развития экспериментального колита у животных, потреблявших водопроводную воду без добавок, отмечено переполнение верхнего, невоспаленного, участка ободочной кишки жидкой фекальной массой, сохранялись диарея, отек (0,96 ± 0,05 г, n = 5) расположенного ниже пораженного (по визуальной оценке) участка, что по срокам соответствует литературным данным [8, 10]. Повреждение кишки составило 2,5 ± 0,22 балла. Заметно ослабевала воспалительная гиперемия. В отдельных случаях диарея и воспалительные изменения макроструктуры кишки имели место и на 14—16-е сутки, тогда как у основной массы особей к этому времени происходило самопроизвольное заживление очагов воспаления.
Через трое суток фитолечения, то есть на 6-е сутки после инициирования колита, почти у всех крыс закончились диарея и геморрагии, но был испачкан хвост в области ануса (следы прошедшей диареи), причем у некоторых содержимое кишки из жидкокровянистого стало пастообразным, а у других появились оформленные фекальные pellets, что указывает на тенденцию к практическому восстановлению как структурных повреждений, так и процессов, ответственных за абсорбцию воды. Существенно уменьшились либо были незначительными отеки, эритемы, отсутствовали крупные линейные эрозивные повреждения слизистой оболочки, что свидетельствует о заметном противовоспалительном влиянии изучаемого фитопрепарата на последствия химического колита. В результате проведенных исследований выявлено, что общее количество повреждений (суммарно в баллах) после действия препарата «Компротэкс» уменьшилось до 2,1 ± 0,3 балла, n = 10, Р < 0,05, тогда как на пике экспериментального колита составляло, как отмечалось выше, 6,6 ± 0,51 балла (n = 25). Отношение влажного веса кишки к весу крысы в среднем равнялось 0,82 ± 0,66 г, n = 10, Р < 0,05, тогда как в контроле, в разгар колита без лечения, — 1,51 ± 0,05 г (n = 25).
В отдельной серии опытов на 7-е сутки экспериментального колита при употреблении с питьем вместо лекарства 1%-го раствора спирта кишечный коэффициент составил 1,17 ± 0,05 г (n = 9), что относительно меньше, чем в группе не получавших лечение животных (1,51 ± 0,048 г). Воспалительная гиперемия проявлялась слабо, в виде редких пятен на серозной оболочке, либо отсутствовала. Толстая кишка была переполнена содержимым, наблюдалась выраженная диарея. Повреждения кишки составили 2,3 ± 0,23 балла (n = 6). В целом можно констатировать, что 1%-й раствор спирта сам по себе не оказывает на кишку в условиях данного исследования существенного целебного действия.
В другой серии опытов, чтобы определить возможность протекторного влияния препарата на развитие экспериментального колита, сразу же после введения уксусной кислоты и помещения в клетку вивария был обеспечен свободный доступ животных к растворенному лекарству или спирту в течение 5 суток. На 6-е сутки измеряли уровень отека ткани путем вычисления кишечного весового коэффициента, сопоставляя его с аналогичным показателем у крыс с колитом без лечения. Весовой индекс уменьшился практически до уровня этого показателя у здоровых особей (0,72 ± 0,05 г,
n = 5, Р < 0,05). Повреждения составили 2,1 ± 1,6 балла. Эти данные свидетельствуют о протекторном действии препарата «Компротэкс» и целесообразности его дальнейших испытаний в качестве средства профилактики колита.
Итак, сравнение числа и объема повреждений нисходящей ободочной кишки, а также кишечного коэффициента в условиях экспериментального колита до и после лечения фитопрепаратом показало достоверное уменьшение значений исследуемых показателей воспалительного процесса и исчезновение симптомов болезни. На основании этого можно заключить, что «Компротэкс» обладает определенным противовоспалительным действием.
Воздействие «Компротэкса» на моторику толстой кишки
Помимо стандартных тестов оценки дей¬ствия препарата на вышеназванные клинические симптомы и морфологические нарушения слизистой оболочки кишки в условиях колита нами было изучено функциональное состояние наиболее поврежденного участка толстой кишки путем отведения от него электрической активности гладких мышц, то есть по состоянию кишечной моторики в условиях воспаления.
У здоровых животных ПГМ нисходящей ободочной кишки представляли собой высокоамплитудные медленные волны характерной частоты и пиковые потенциалы на них, либо независимо от медленных волн одиночные спайки или пачки, следующие ритмично или аритмично. В 9 опытах данные электрической активности за минуту, усредняемые в каждом опыте за 30—40 мин регистрации, составили 90,0 ± 4,0 мкВ (рис. 1А, 1—2).
В условиях экспериментального колита электромиографические паттерны каудальной части толстой кишки в месте повреждения по сравнению с соответствующим участком в норме были значительно ослаблены: амплитуда и частота специфических электрических осцилляций — базального ритма — намного ниже, чем у здоровых животных, а характерная для нормы высокоамплитудная пиковая активность в воспаленной толстой кишке отсутствовала или сохранялась на довольно низком уровне (рис. 1Б, 1—2). Средние данные амплитуд ПГМ нисходящей ободочной кишки в 8 опытах на крысах, находящихся в состоянии острого (3—4 суток от момента введения кислоты) колита, составили 18,3 ± 1,8 мкВ. Иными словами, электрическая активность гладких мышц по сравнению с фоном ослабевала более чем в 4 раза. Указанные изменения ПГМ отражают угнетение моторики нисходящей ободочной кишки, пораженной экспериментальным колитом. Действительно, в соответствии с данными литературы, воспаление уменьшает количество спонтанных фазических сокращений, ухудшает миогенное и нервное их регулирование, подавляет фазическую сократительную активность миоцитов, снижает амплитуду ПГМ толстой кишки [4, 5, 7].
В специальных опытах мы изучали продолжительность фазы угнетения электрической активности гладких мышц в условиях экспериментального колита, развивающегося самопроизвольно, без какого-либо лечения. Оказалось, что уменьшение ПГМ имело место не только на 3—4-е сутки, как отмечено выше, но и далее — на 6—8-е — 16,9 ± 3,6 мкВ (n = 11). Для этого периода характерно наличие нерегулярных вспышек пиковых потенциалов невысокой амплитуды.
Попутно отметим, что гладкие мышцы кишки, расположенные рядом и краниальнее воспаленного, некротизированного, наполненного кровянистым содержимым сегмента, по показателю электрической активности практически не отличались от нормы (86,6 ± 2,4 мкВ), разряжаясь высокоамплитудными одиночными и/или пачками быстрых импульсов на медленных волнах деполяризации.
Через трое суток фитолечения (то есть на 7-е сутки после введения уксусной кислоты) уровень ПГМ пораженного колитом участка толстой кишки крыс, получающих «Компротэкс» (рис. 2), повысился до 50,7 ± 6,8 мкВ (7 опытов). Появлялись высокоамплитудные пиковые потенциалы — как одиночные, так и сгруппированные. Сделан вывод, что данный препарат увеличивает уровень электрической активности пораженных участков толстой кишки, способствуя тем самым восстановлению моторики примерно до уровня, составляющего больше половины исходной (нормальной) ее активности (рис. 2, 3). Контрольными для этой серии были специальные опыты с регистрацией на 7-е сутки экспериментального колита ПГМ нисходящей ободочной кишки крыс, потреблявших 1%-й спиртовой раствор, то есть не получавших лечение. Суммарная амплитуда ПГМ в этих опытах (рис. 4) составила 24,3 ± 5,2 мкВ (n = 10). Следовательно, спирт данной концентрации может вносить определенный вклад в увеличение электрической активности, а значит, в процесс восстановления нарушенной экспериментальным колитом моторики ободочной кишки. Однако в нашем случае положительная динамика изменения моторики кишки проявляется как тенденция, а не как статистически подтвержденная закономерность.
Восстановление под влиянием фитопрепарата моторной функции толстой кишки, пораженной экспериментальным колитом, а также протекторное и противовоспалительное действие «Компротэкса» обусловлено наличием в его составе комплекса физиологически активных веществ. Флавоноиды растительных экстрактов способствуют снижению активности холинестеразы, увеличивая тем самым продолжительность действия ацетилхолина, основного возбуждающего медиатора кишечника, чем могут быть объяснены стимулирующие моторику эффекты исследуемого нами лекарственного вещества [1]. Присутствие полифенолов в растительных экстрактах позитивно сказывается на кишечном кровообращении, с чем можно связать исчезновение геморрагических осложнений и отсутствие выраженной гиперемии после лечения фитопрепаратом. Кроме того, улучшение кровообращения напрямую обусловлено стимулирующим влиянием моторной ритмической активности кишки на местную гемодинамику. Определенный вклад в усиление моторики может вносить спазмолитическое действие изучаемого препарата, так как компоненты экстрагируемых эфирных масел, содержащихся в соцветиях растений, обладают миотропной активностью [1, 2].
Таким образом, показания к применению для лечения колитов препарата «Компротэкс» — экстракта растений, произрастающих в Беларуси, — в рамках его комплекс¬ного фармакотерапевтического действия подтверждаются настоящим исследованием, в частности фактами заживления воспалительных повреждений толстой кишки, а также восстановлением и тенденцией к нормализации ее моторной активности как важного звена патогенеза болезней воспаленной кишки.