Известно, что цинк принимает участие во многих физиологических процессах, протекающих в организме человека. Допустимая его концентрация в сыворотке крови не должна превышать 30 мкмоль/л, а уровень свободного внутриклеточного Zn2+ в эритроцитах составляет порядка 10-11 М [1]. Ионы цинка стабилизируют клеточные мембраны и являются кофактором большого количества ферментов — лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы, карбоангидразы, ДНК-, РНК-полимераз и др.

Недостаток этого микроэлемента в организме вызывает такие патологические состояния, как рассеянный склероз, болезнь Крона, энтеропатический акродерматит, муковисцидоз и др. Показано, что повышение уровня ионов цинка оказывает влияние на антиоксидантную систему клеток, а именно приводит к снижению активности каталазы, глутатионпероксидазы и супероксиддисмутазы [2]. Следствием инкубации эритроцитов in vitro в среде с миллимолярными концентрациями Zn2+ является усиление гемолиза и значительные изменения внутриклеточного уровня глюкозы [3]. Обнаружено, что активности Na+, K+-АТФазы и Ca2+, Mg2+-АТФазы находятся в тесной взаимосвязи с концентрацией цинка — при инкубации клеток с 0,5 мМ Zn2+ наблюдается снижение активности этих ферментов [4]. Ионы цинка в высоких концентрациях действуют как клеточные токсиканты и, как следствие, изменяют свойства эритроцитарной мембраны. Установлено, что Zn2+ в концентрации 0,05 мМ индуцирует конформационные изменения в цитоплазматическом домене белка полосы 3, которые в свою очередь передаются мембранному домену, в результате чего происходит ингибирование его анион-транспортной активности [5]. При помощи тонкослойной хроматографии обнаружено, что ионы цинка в концентрации 1 мМ оказывают значительное влияние на долю фосфолипидов в мембранах эритроцитов — наблюдаются снижение количества фосфатидилхолина и увеличение содержания фосфатидилсерина и фосфатидилинозитола [2]. Ранее было показано, что ионы цинка вызывают изменение микровязкости липидного бислоя мембран эритроцитов карпа (в концентрациях 0,1—1 мМ) [3], тромбоцитов человека [6], лейкемических Т-клеток человека и фибробластов крыс (1,5 мМ) [7]. В работах, выполненных ранее в нашей лаборатории на эритроцитах человека, установлено, что ионы цинка в области концентраций от 0,01—2 мМ усиливают тепловую везикуляцию эритроцитов, что обусловлено окислением SH-групп мембранных белков, снижают активности мембраносвязанных ацетилхолинэстеразы и метгемоглобинредуктазы, а также вызывают изменение микровязкости мембранных липидов [8]. Более того, методом атомно-силовой микроскопии показано, что тонкая структура поверхности мембран эритроцитов, подвергшихся воздей¬ствию ионов цинка, изменяется: после воздействия на эритроциты 2 мМ ZnSO4 происходит сглаживание шероховатостей на поверхности мембран вследствие, по-видимому, кластирования белка полосы 3 и отделения от поверхности мембран бесспектриновых везикул [9]. Известно, что эритроцитарные мембраны выделяются среди других высоким содержанием холестерина. Однако роль холестерина — одного из главных компонентов липидного бислоя мембраны, в Zn-индуцируемых изменениях мембран эритроцитов — неизвестна.
Цель данной работы — определить участие холестерина в изменениях физического состояния липидного бислоя мембран эритроцитов, подвергшихся воздействию высоких концентраций ионов цинка.
Для этого была использована кровь здоровых доноров в консерванте «глюгицир», полученная из Республиканского научно-практического центра гематологии и трансфузиологии.
Эритроциты отделяли от плазмы путем центрифугирования крови при 2000 g 10 мин и трижды отмывали в 155 мМ NaCl. Эритроцитарные мембраны выделяли по методу Доджа. Концентрацию белка в тенях эритроцитов измеряли по модифицированному методу Лоури.
Изолированные мембраны эритроцитов обрабатывали 0,1 мМ, 5 мМ, 1 мМ сульфата цинка и инкубировали при 37 °С в течение 1 часа.
Об изменении физического состояния мембран эритроцитов судили по степени поляризации флуоресценции липофильного зонда 1-(4-триметиламмоний-фенил)-6-фенил-1,3,5-гексатриена p-толуен-сульфоната (ТМА-ДФГ) и по изменению генерализованной поляризации 6-додеканол-2-диметиламинонафталена (лаурдана), о количестве свободного холестерина в мембранах эритроцитов — по величине интенсивности флуоресценции полиенового антибиотика филипина.
Флуоресцентные измерения проводили на спектрофлуориметре СМ2203 («СОЛАР», Беларусь), а спектрофотометрические — на спектрофотометре Specord M-40 (Германия). В работе применялись следующие химические реагенты: филипин, лаурдан, диметилсульфоксид (Sigma, США); ТМА-ДФГ (Мolecular Probes, США); сульфат цинка, хлорид натрия, натрий фосфорнокислый («Реахим», Россия).
Результаты экспериментов анализировали методом вариационной статистики с использованием параметрического критерия Стьюдента. В работе представлены средние значения из 6—8 независимых экспериментов.
Исследование физического состояния липидов в мембранах эритроцитов после воздействия на изолированные эритроцитарные мембраны ионов Zn2+ в концентрациях 0,1—1,0 мМ показало, что происходит повышение степени поляризации флуоресценции липофильного зонда ТМА-ДФГ (рис. 1А). Так как ТМА-ДФГ локализуется вблизи поверхности липидного бислоя, можно предположить, что происходит увеличение микровязкости липидов в области полярных головок внешнего липидного монослоя мембран эритроцитов. В то же время достоверных изменений генерализованной поляризации (GP) лаурдана при тех же концентрациях ионов Zn2+ не наблюдалось (рис. 1Б), что может свидетельствовать об отсут¬ствии изменений микровязкости липидов в области гидрофобной части внешнего липидного монослоя. Это подтверждает обнаруженный ранее факт, что ионы цинка, как правило, не легко проникают в глубь липидного бислоя [10].
Для того чтобы изучить участие холестерина, входящего в состав мембран эритроцитов, в ответах мембраны на воздействие различных концентраций ионов цинка, нами был применен филипин. В настоящее время установлено, что данный полиеновый антибиотик, обладающий собственной флуоресценцией с максимумом люминесценции при 482 нм (?возб. = 340 нм) и взаимодействующий с холестеринсодержащими участками мембран клеток, может быть использован как зонд на присутствие и гетерогеннность распределения стеролов в биологических мембранах [11]. Филипин в высоких концентрациях (10-2—10-4 М) способен даже нарушить липидный бислой, то есть действовать как разрушающий агент. Однако при его концентрации порядка 10-5 М липидный бислой мембран остается неповрежденным, то есть он может применяться в качестве флуоресцентного зонда [12]. В настоящем исследовании был использован 5•10-6 М раствор филипина в диметилсульфоксиде.
Как уже упоминалось выше, по величине интенсивности флуоресценции филипина можно судить о количестве свободного холестерина в мембранах клеток [11]. Поэтому в данной работе этот параметр использовали в качестве показателя сродства филипина к холестерину. Из представленных на рис. 2 данных видно, что при действии на изолированные эритроцитарные мембраны ионов Zn2+ в концентрациях 0,1—1 мМ происходит снижение интенсивности флуоресценции филипина, которое можно объяснить образованием холестерин-полиеновых агрегатов, вследствие чего может уменьшиться число мест связывания в мембране для филипина. Существенных модификаций формы спектров испускания флуоресценции не обнаружено.
Полученные данные позволяют сделать вывод, что ионы цинка в концентрации 0,1—1 мМ, взаимодействуя с плазматической мембраной эритроцитов человека, могут видоизменять не только состояние фосфолипидов, но и холестерина мембран, при этом происходит изменение микровязкости липидного бислоя мембраны, что способно приводить к нарушению функционирования клетки.