Выяснение механизмов функционирования белков в составе биомембран является одной из актуальных проблем современной биофизики. Важную роль в осуществлении белками функциональных нагрузок играет их структурное состояние — конформация и внутримолекулярная динамика (ВМД) [1]. Конформацию белка — топографию укладки полипептидной цепи в объеме глобулы — можно рассматривать как статичную структуру. В реальных условиях функционирования она не статична. Различные элементы структуры глобулы непрерывно флуктуируют — совершают тепловые колебательные и вращательные движения вблизи положения равновесия. Характерные времена внутримолекулярных движений, среди которых наибольшее значение для функционирования белка имеют медленные (миллисекундные и секундные), лежат в очень широком диапазоне — от пикосекунд до секунд. Эти движения представляют собой тепловые флуктуации больших фрагментов полипептидной цепи, смещение доменов и субъединиц относительно друг друга. В настоящее время детально изучена роль конформационного состояния белков в реализации и регуляции функций биомембран. Однако вопрос о функциональной роли вну¬тримолекулярной динамики мембранных белков остается во многом невыясненным. Существенным препятствием здесь является ограниченность методов исследования ВМД в составе мембран.
Уникальные возможности изучения ВМД белков в миллисекундном и секундном диапазонах предоставляет метод, основанный на измерении параметров триптофановой фосфоресценции при комнатной температуре (ТФКТ). Выраженная зависимость значений времени жизни и квантового выхода триптофановой фосфоресценции от молекулярной подвижности окружения хромофора и соответ¬ствие времен жизни ТФКТ характерным временам низкочастотных флуктуаций структуры макромолекул позволяют изучать фосфоресцентным методом медленную ВМД белков в диапазоне 10-3—10 с [1, 2]. Впервые метод ТФКТ для анализа миллисекундной ВМД белков в составе биологических мембран был предложен в 1976 г. [3]. Позднее показано, что в клетке способностью к миллисекундной ТФКТ обладают в основном лишь мембранные белки, в то время как у большинства водорастворимых фосфоресцентный сигнал отсутствует [1, 4, 5]. Это обусловлено различиями их медленной внутримолекулярной динамики. У большинства водорастворимых клеточных белков осуществляются интенсивные внутримолекулярные движения, которые приводят к тушению ТФКТ до уровня, не позволяющего ее надежно регистрировать. Контрастные различия в способности к ТФКТ мембранных и водорастворимых клеточных белков предоставляют уникальную возможность селективного мониторинга медленной внутримолекулярной динамики мембранных белков in situ без предварительного выделения их из клеток. Лишь в тех относительно редких случаях, когда в цитоплазме и матриксе органелл в повышенной концентрации присутствуют водорастворимые белки с аномально жесткой структурой, они могут вносить ощутимый вклад в фосфоресцентный сигнал клетки [5]. Метод ТФКТ успешно используется для изучения медленной ВМД белка в растворе [1]. Однако вплоть до последнего времени сведения о ТФКТ белков в составе биомембран в литературе (кроме работ [1, 4—6]) отсутствуют.
Важным фактором, контролирующим структуру белков, является концентрация ионов водорода в растворе. Если конформационное состояние мембранных белков в широком диапазоне pH-среды изучено детально, то вопрос о том, как при этом изменяется их медленная ВМД, остается открытым. Не выяснено, как различаются по структурно-динамическому состоянию интегральные и периферические белки. Представляет интерес изучение закономерности изменения ВМД при модификации белок-белковых взаимодействий в мембране.
В этой работе даны результаты фосфоресцентного анализа медленной ВМД белков в составе изолированных нативных мембран эритроцитов человека и с модифицированным цитоскелетом в условиях изменения концентрации ионов водорода в интервале значений pH 4—9.
При исследовании использовали суспензии изолированных мембран эритроцитов человека (0,15 М Na2HPO4 — лимонная кислота буфер рН 7,4), выделенных из свежей донорской крови по методу Доджа и др. [7]. Концентрацию белка в препаратах мембран определяли по методу Лоури в модификации Марквелла [8]. Обеднение мембран по спектрину осуществляли по методу Беннетта [9]. Полноту удаления спектрина контролировали методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия [10]. При изучении зависимости кинетики затухания ТФКТ мембранных белков от рН-среды суспензии мембран инкубировали в указанном выше буфере с заданными значениями рН при 20 °С в течение 60 мин. Кинетику затухания ТФКТ эритроцитарных мембран регистрировали с помощью автоматизированного высокочувствительного устройства с монохроматорами в каналах возбуждения и регистрации [11]. Возбуждение ТФКТ проводили при длине волны 297 нм, регистрацию кинетики затухания ТФКТ — при 441 нм. Удаление кислорода из суспензии мембран осуществляли с помощью сульфита натрия в конечной концентрации 50 мМ [6].
На рис. 1а (кривая 1) представлен спектр ТФКТ суспензии изолированных мембран эритроцитов человека (рН 7,4) при возбуждении 297 нм. Как видно, спектр ТФКТ содержит максимумы при 415, 441 и 465 нм, характерные для других триптофансодержащих объектов. Кинетика затухания ТФКТ суспензии нативных изолированных мембран эритроцитов представлена на рис. 1б (кривая 1). Кривая хорошо аппроксимируется суммой двух экспоненциальных компонент с различными временами жизни и вкладами. Значения времени жизни быстрой (?1) и медленной (?2) компонент, вклада быстрой компоненты (?1) ТФКТ мембран составляют: ?1 = 96 ± 10 мс; ?2 = 310 ± 45 мс; ?1 = 0,6 ± 0,1 соответственно. Конкретные значения спектральных и кинетических параметров ТФКТ несколько варьировали у препаратов, полученных из крови различных доноров. Высокие по отношению к большинству водорастворимых белков значения ?1 и ?2 ТФКТ суспензий мембран свидетельствуют о том, что способные к фосфоресценции при комнатной температуре мембранные белки характеризуются достаточно высокой жесткостью структуры. Наблюдаемую биэкспоненциальность кинетических кривых затухания фосфоресценции можно объяснить неодинаковой внутримолекулярной динамикой в местах локализации триптофанилов одних и тех же и/или различных мембранных белков.
С целью выяснения роли спектрина в контроле ВМД мембранных белков эри¬троцита «тени» на 95% обедняли по этому цитоскелетному белку. Подтверждением удаления спектрина из состава мембраны являются представленные на рис. 2 электрофореграммы белков нативных мембран эритроцитов человека (а) и мембран после удаления из них спектрина (в). Видно, что в нативных мембранах хорошо выражены полосы 1 и 2, соответствующие спектрину (б), а после его экстракции они практически исчезают. Результатом удаления из состава мембран 95% спектрина является заметное тушение ТФКТ, характеризующееся снижением (приблизительно в два раза) ее начальной интенсивности (рис. 1а, кривая 2) и ускорением затухания (рис. 1б, кривая 2). Значение ?1 ТФКТ спектринобедненных «теней» эритроцитов уменьшается по сравнению с нативными мембранами в 1,9 раза, а ?2 — в 1,3 раза (рис. 3а и 3б, кривые 2). Наблюдаемый эффект говорит о значительном усилении медленной внутримолекулярной динамики структуры оставшихся в мембране после удаления спектрина белков. В отличие от входящих в состав мембраны белков, спектринсодержащий экстракт не обладал способностью к миллисекундной ТФКТ (рис. 1а, кривая 3). Это свидетельствует о существовании в спектрине интенсивных внутримолекулярных движений с миллисекундными характерными временами, следствием которых является сильное тушение фосфоресценции, препятствующее ее регистрации. Поскольку после удаления спектрина из состава мембран тушение ТФКТ оставшихся белков значительно усиливается, можно сделать вывод о том, что спектриновая сеть ограничивает внутримолекулярную динамику мембранных белков в эритроците.
Вывод об участии спектрина в контроле ВМД структуры мембранных белков подтверждается результатами экспериментов по изучению зависимости кинетики затухания ТФКТ суспензии мембран эритроцитов от рН-среды в интервале значений 4—6. Известно, что закисление среды в этом интервале вызывает агрегацию спектрина в мембране эритроцита [12]. Как показано нами ранее методом ТФКТ [1], агрегация белков в растворе уменьшает их медленную внутримолекулярную динамику. На рис. 3а и 3б (кривые 1) представлены рН-зависимости значений быстрой (?1) и медленной (?2) компонент ТФКТ суспензий мембран эритроцитов человека. Видно, что закисление среды в интервале рН 6—4 приводит к росту значений ?1 ТФКТ в 2 раза, а ?2 — в 2,5 раза. Это свидетельствует о снижении эффективности тушения ТФКТ мембран, наиболее вероятной причиной которого является возрастание жесткости структуры спектрина вслед¬ствие его агрегации.
При изучении действия рН в интервале 6—6,5 обнаружено, что значения ?1 и ?2 ТФКТ белков мембран имеют минимальный и постоянный уровень — 31 ± 7 и 142 ± 37 мс соответственно (рис. 3а и 3б, кривые 1). Защелачивание среды в диапазоне рН 6,5—9 приводит к росту значений ?1 и ?2 ТФКТ. При этом значения ?1 ТФКТ наиболее выраженно увеличиваются в 6 раз (с 31 ± 7 до 167 ± 12 мс), ?2 ТФКТ — в 7,5 раза (с 142 ± 37 до 1064 ± 93 мс) в интервале значений рН 7,2—9. Это свидетельствует о снижении низкочастотных флуктуаций структуры мембранных белков. Поскольку спектриновый цитоскелет при повышенных значениях рН увеличивается в размерах [13], его структура становится менее упорядоченной и более лабильной. Можно предположить, что наблюдаемый эффект возрастания жесткости структуры мембранных белков связан не с участием спектрина. Вероятно, регистрируемое резкое ограничение подвижности микроокружения триптофановых остатков мембранных белков при увеличении рН в щелочную сторону обусловлено описанной в литературе [14] ассоциацией тетрамеров белка полосы 3 в олигомерные структуры в области их цитоплазматических доменов или образованием дополнительных сайтов взаимодействия этих доменов с белками полосы 4.1, 4.2, анкирином, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой и другими белками [15, 16].
При исследовании зависимости значений ?1 и ?2 ТФКТ белков мембран с модифицированным спектриновым цитоскелетом от рН-среды эффект возрастания кинетических параметров в интервалах 6—4 и 7,2—9 в препаратах оказался ниже. Учитывая этот факт, можно сделать вывод о том, что цитоскелетный белок спектрин играет важную роль в ограничении ВМД мембранных белков.
Таким образом, рН-среда является значимым регуляторным фактором медленной ВМД белков в мембране. Полученные результаты подтверждают, что инте¬гральные белки эритроцитарных мембран и периферический белок спектрин резко различаются по структурно-динамическому состоянию. В интегральных белках миллисекундные движения элементов структуры в значительной степени ограничены по сравнению со спектрином. Иными словами, жесткость структуры интегральных белков значительно выше спектрина. Вместе с тем спектрин, формируя каркас мембраны эритроцита, ограничивает низкочастотные флуктуации структуры мембранных белков эритроцитов человека. Обнаруженное фосфоресцентным методом различие в жесткости структуры интегральных белков мембраны и спектрина можно объяснить повышенным содержанием в интегральных белках ?-спиралей и ?-структур, а также снижением медленных флуктуаций структуры интегральных белков в результате их изоляции от подвижного водного окружения, наличия белок-липидных и белок-белковых взаимодействий. Последние являются наиболее вероятной причиной стабилизирующего влияния спектрина на внутримолекулярную динамику инте¬гральных белков.